Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Toxoplasma gondii është një parazit protozoar ndërqelizor që modulon mikromjedisin e bujtësit të infektuar dhe dihet se lidhet me incidencën e rritjes së tumorit të trurit.Në këtë studim, ne supozojmë se miRNA-21 ekzosomale nga infeksioni Toxoplasma nxit rritjen e tumorit të trurit.Ekzozomet nga mikroglia BV2 e infektuar me Toksoplazmë u karakterizuan dhe u konfirmua përbrendësimi i qelizave glioma U87.Profilet e shprehjes së mikroARN-së ekzosomale u analizuan duke përdorur grupe të microRNA dhe microRNA-21A-5p të lidhura me Toxoplasma gondii dhe klasifikimin e tumorit.Ne hetuam gjithashtu nivelet e mRNA të gjeneve të lidhura me tumorin në qelizat e gliomës U87 duke ndryshuar nivelet e miR-21 në ekzosome dhe efektin e ekzosomeve në përhapjen e qelizave glioma U87 të njeriut.Në ekzosomet e qelizave glioma U87 të infektuara me Toxoplasma gondii, shprehja e mikroRNA-21 rritet dhe aktiviteti i gjeneve antitumorale (FoxO1, PTEN dhe PDCD4) zvogëlohet.Ekzozomet me prejardhje nga BV2 të infektuara me Toxoplasma nxisin proliferimin e qelizave glioma U87.Ekzozomet nxisin rritjen e qelizave U87 në një model të tumorit të miut.Ne sugjerojmë që rritja e miR-21 ekzosomale në mikroglinë BV2 të infektuar me Toksoplazmë mund të luajë një rol të rëndësishëm si një nxitës i rritjes së qelizave në qelizat e gliomës U87 duke ulur poshtë gjenet antitumorale.
Është vlerësuar se më shumë se 18.1 milionë raste të kancerit të avancuar janë diagnostikuar në mbarë botën në vitin 2018, me rreth 297,000 tumore të sistemit nervor qendror të diagnostikuar çdo vit (1.6% e të gjithë tumoreve)1.Hulumtimet e mëparshme kanë treguar se faktorët e rrezikut për zhvillimin e tumoreve të trurit të njeriut përfshijnë produkte të ndryshme kimike, histori familjare dhe rrezatim jonizues nga pajisjet terapeutike dhe diagnostikuese të kokës.Megjithatë, shkaku i saktë i këtyre sëmundjeve malinje është i panjohur.Përafërsisht 20% e të gjithë kancereve në mbarë botën shkaktohen nga agjentë infektivë, duke përfshirë viruset, bakteret dhe parazitët3,4.Patogjenët infektivë prishin mekanizmat gjenetikë të qelizës pritëse, si riparimi i ADN-së dhe cikli qelizor, dhe mund të çojnë në inflamacion kronik dhe dëmtim të sistemit imunitar5.
Agjentët infektivë të lidhur me kancerin e njeriut janë patogjenët viralë më të zakonshëm, duke përfshirë papillomaviruset e njeriut dhe viruset e hepatitit B dhe C.Parazitët gjithashtu mund të luajnë një rol të mundshëm në zhvillimin e kancerit njerëzor.Disa lloje parazitësh, konkretisht Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis dhe Hymenolepis nana, janë implikuar në lloje të ndryshme të kancerit njerëzor 6,7,8.
Toxoplasma gondii është një protozoar ndërqelizor që rregullon mikromjedisin e qelizave pritëse të infektuara.Ky parazit vlerësohet të infektojë afërsisht 30% të popullsisë së botës, duke e vënë në rrezik të gjithë popullsinë9,10.Toxoplasma gondii mund të infektojë organet vitale, duke përfshirë sistemin nervor qendror (SNQ) dhe të shkaktojë sëmundje serioze si meningjiti fatal dhe encefaliti, veçanërisht në pacientët me imunitet të komprometuar9.Megjithatë, Toxoplasma gondii mund të ndryshojë gjithashtu mjedisin e bujtësit të infektuar duke moduluar rritjen e qelizave dhe përgjigjet imune në individët imunokompetent, duke çuar në mbajtjen e një infeksioni kronik asimptomatik9,11.Interesante, duke pasur parasysh korrelacionin midis prevalencës së T. gondii dhe incidencës së tumorit të trurit, disa raporte sugjerojnë se ndryshimet mjedisore të bujtësit in vivo për shkak të infeksionit kronik të T. gondii i ngjajnë mikromjedisit të tumorit.
Ekzozomet njihen si komunikues ndërqelizor që japin përmbajtje biologjike, duke përfshirë proteinat dhe acidet nukleike, nga qelizat fqinje16,17.Ekzozomet mund të ndikojnë në proceset biologjike të lidhura me tumorin si anti-apoptoza, angiogjeneza dhe metastazat në mikromjedisin e tumorit.Në veçanti, miARN-të (miRNA), ARN të vogla jo-koduese me gjatësi rreth 22 nukleotide, janë rregullatorë të rëndësishëm të gjeneve post-transkriptuese që kontrollojnë më shumë se 30% të mARN-së njerëzore përmes kompleksit të heshtjes së induktuar nga miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii mund të prishë proceset biologjike duke kontrolluar shprehjen e miRNA në bujtësit e infektuar.MiRNA-të e hostit përmbajnë sinjale të rëndësishme për rregullimin e proceseve biologjike të bujtësit për të arritur strategjinë e mbijetesës së parazitit.Kështu, studimi i ndryshimeve në profilin e miRNA të bujtësit pas infeksionit me T. gondii mund të na ndihmojë të kuptojmë më qartë ndërveprimin midis hostit dhe T. gondii.Në të vërtetë, Thirugnanam et al.15 sugjeroi që T. gondii promovon kancerogjenezën e trurit duke ndryshuar shprehjen e tij në miRNA-të specifike të bujtësit të lidhura me rritjen e tumorit dhe zbuloi se T. gondii mund të shkaktojë glioma në kafshët eksperimentale.
Ky studim fokusohet në ndryshimin e miR-21 ekzosomal në mikroglia pritëse të infektuara me Toxoplasma BV2.Ne vëzhguam një rol të mundshëm të miR-21 ekzosomal të ndryshuar në rritjen e qelizave glioma U87 për shkak të mbajtjes në bërthamën e FoxO1/p27, e cila është objektivi i miR-21 të mbishprehur.
Ekzozomet që rrjedhin nga BV2 u morën duke përdorur centrifugim diferencial dhe u vërtetuan me metoda të ndryshme për të parandaluar kontaminimin me komponentë qelizorë ose vezikula të tjera.Elektroforeza e xhelit SDS-poliakrilamid (SDS-PAGE) tregoi modele të dallueshme midis proteinave të nxjerra nga qelizat BV2 dhe ekzosomeve (Figura 1A), dhe mostrat u vlerësuan për praninë e Alix, i cili u analizua nga Western blotting i shënuesve të proteinave ekzosomale në.Etiketimi Alix u gjet në proteinat ekzosome por jo në proteinat e lizatit të qelizave BV2 (Fig. 1B).Për më tepër, ARN-ja e pastruar nga ekzosomet që rrjedhin nga BV2 u analizua duke përdorur një bianalizues.Nën-njësitë ribozomale 18S dhe 28S janë vërejtur rrallë në modelin e migrimit të ARN-së ekzosomike, duke treguar pastërti të besueshme (Figura 1C).Së fundi, mikroskopi elektronik i transmisionit tregoi se ekzosomet e vëzhguara ishin rreth 60-150 nm në madhësi dhe kishin një strukturë të ngjashme me filxhanin tipike për morfologjinë e ekzosomeve (Fig. 1D).
Karakterizimi i ekzosomeve që rrjedhin nga qelizat BV2.(A) Faqja e fletës së të dhënave të sigurisë.Proteinat u izoluan nga qelizat BV2 ose ekzosome që rrjedhin nga BV2.Modelet e proteinave ndryshojnë midis qelizave dhe ekzosomeve.(B) Analiza Western blot e një shënuesi ekzosomal (Alix).(C) Vlerësimi i ARN-së së pastruar nga qelizat BV2 dhe ekzosomet e derivuara nga BV2 duke përdorur një bianalizues.Kështu, nën-njësitë ribozomale 18S dhe 28S në qelizat BV2 u gjetën rrallë në ARN ekzosomike.(D) Mikroskopi elektronik transmetues tregoi se ekzosomet e izoluara nga qelizat BV2 u ngjyrosën negativisht me 2% acetat uranil.Ekzozomet janë afërsisht 60-150 nm në madhësi dhe në formë kupe (Song dhe Jung, të dhëna të pabotuara).
Brendësimi qelizor i ekzosomeve të derivuara nga BV2 në qelizat e gliomës njerëzore U87 u vëzhgua duke përdorur mikroskopinë konfokale.Ekzozomet e etiketuara me PKH26 lokalizohen në citoplazmën e qelizave U87.Bërthamat u ngjyrosën me DAPI (Fig. 2A), duke treguar se ekzosomet e derivuara nga BV2 mund të përvetësohen nga qelizat pritëse dhe të ndikojnë në mjedisin e qelizave marrëse.
Brendësia e ekzosomeve të derivuara nga BV2 në qelizat e gliomave U87 dhe ekzosomet e derivuara nga BV2 të infektuara me Toxoplasma RH nxiti përhapjen e qelizave glioma U87.(A) Ekzozomet e përfshira nga qelizat U87 të matura me mikroskop konfokal.Qelizat glioma U87 u inkubuan me ekzosome të etiketuara me PKH26 (e kuqe) ose pa kontroll për 24 orë.Bërthamat u ngjyrosën me DAPI (blu) dhe më pas u vëzhguan nën një mikroskop konfokal (shiriti i shkallës: 10 μm, x 3000).(B) Proliferimi i qelizave glioma U87 u përcaktua nga analiza e proliferimit të qelizave.Qelizat glioma U87 u trajtuan me ekzosome për kohën e treguar. *P < 0.05 u përftua me testin e Studentit. *P < 0.05 u përftua me testin e Studentit. *P < 0,05 poluçeno по t-критерию Стьюдента. *P <0.05 nga T-testi i Studentit. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 e përftuar duke përdorur testin e Studentit t.
Pas konfirmimit të brendësimit të ekzosomeve me prejardhje nga BV2 në qelizat e gliomës U87, ne kryem analizat e proliferimit të qelizave për të hetuar rolin e ekzosomeve të derivuara nga BV2 nga Toxoplasma në zhvillimin e qelizave të gliomës njerëzore.Trajtimi i qelizave U87 me ekzosome nga qelizat BV2 të infektuara me T. gondii tregoi se ekzosomet e derivuara nga BV2 të infektuara me T. gondii shkaktuan një proliferim dukshëm më të lartë të qelizave U87 në krahasim me kontrollin (Fig. 2B).
Për më tepër, rritja e qelizave U118 pati të njëjtat rezultate si U87, pasi ekzosomet e stimuluara nga Toxoplasma shkaktuan nivelet më të larta të proliferimit (të dhënat nuk tregohen).Bazuar në këto të dhëna, mund të tregojmë se ekzosomet e infektuara nga Toxoplasma me prejardhje nga BV2 luajnë një rol të rëndësishëm në proliferimin e qelizave glioma.
Për të hetuar efektin e ekzosomeve të derivuar nga BV2 të infektuara nga Toksoplazma në zhvillimin e tumorit, ne injektuam qeliza glioma U87 në minj nudo për një model ksenografti dhe injektuam ekzosome të prejardhura nga BV2 ose ekzosome të rrjedhura nga BV2 të infektuara nga RH.Pasi tumoret u bënë të dukshme pas 1 jave, çdo grup eksperimental prej 5 minjsh u nda sipas madhësisë së tumorit për të përcaktuar të njëjtën pikë fillestare dhe madhësia e tumorit u mat për 22 ditë.
Në minjtë me modelin e ksenografit U87, madhësia dhe pesha e tumorit dukshëm më e madhe u vu re në grupin ekzosome të infektuar me RH të derivuar nga BV2 në ditën e 22 (Fig. 3A, B).Nga ana tjetër, nuk kishte ndonjë ndryshim domethënës në madhësinë e tumorit midis grupit të ekzosomeve të rrjedhur nga BV2 dhe grupit të kontrollit pas trajtimit me ekzosome.Përveç kësaj, minjtë e injektuar me qeliza glioma dhe ekzosome shfaqën vizualisht vëllimin më të madh të tumorit në grupin e ekzosomeve të derivuar nga BV2 të infektuara me RH (Fig. 3C).Këto rezultate demonstrojnë se ekzosomet e infektuara me Toksoplazmë të derivuar nga BV2 nxisin rritjen e gliomës në një model të tumorit të miut.
Onkogjeneza (AC) e ekzosomeve me prejardhje nga BV2 në një model miu ksenograft U87.Madhësia e tumorit (A) dhe pesha (B) u rritën ndjeshëm në minjtë nudo BALB/c të trajtuar me ekzosome të infektuar me RH që rrjedhin nga BV2.Minjve nudo BALB/c (C) iu injektuan në mënyrë subkutane 1 x 107 qeliza U87 të pezulluara në përzierjen Matrigel.Gjashtë ditë pas injektimit, 100 μg ekzosome të derivuara nga BV2 u trajtuan në minj.Madhësia dhe pesha e tumorit u matën përkatësisht në ditët e treguara dhe pas sakrifikimit. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Të dhënat treguan se 37 miRNA (16 të mbishprehura dhe 21 të pakta) të lidhura me imunitetin ose zhvillimin e tumorit u ndryshuan ndjeshëm në mikroglia pas infeksionit me shtamin Toxoplasma RH (Fig. 4A).Nivelet e shprehjes relative të miR-21 midis miRNA-ve të ndryshuara u konfirmuan nga RT-PCR në kohë reale në ekzosome që rrjedhin nga BV2, ekzosome të trajtuara me qeliza BV2 dhe U87.Shprehja e miR-21 tregoi një rritje të konsiderueshme në ekzosome nga qelizat BV2 të infektuara me Toxoplasma gondii (shtam RH) (Fig. 4B).Nivelet e shprehjes relative të miR-21 në qelizat BV2 dhe U87 u rritën pas marrjes së ekzosomeve të ndryshuara (Fig. 4B).Nivelet relative të shprehjes miR-21 në indet e trurit të pacientëve me tumor dhe minjve të infektuar me Toxoplasma gondii (strajoni ME49) ishin më të larta se në kontrollet, përkatësisht (Fig. 4C).Këto rezultate lidhen me ndryshimet midis niveleve të shprehjes së mikroARN-ve të parashikuara dhe të konfirmuara in vitro dhe in vivo.
Ndryshimet në shprehjen e miP-21a-5p ekzosomike në mikroglia të infektuara me Toxoplasma gondii (RH).(A) Demonstron ndryshime të rëndësishme në siRNA të lidhura me imunitetin ose zhvillimin e tumorit pas infeksionit RH me T. gondii.(B) Nivelet relative të shprehjes miR-21 u zbuluan nga RT-PCR në kohë reale në ekzosomet e derivuara nga BV2, ekzosomet e trajtuara me BV2 dhe qelizat U87.(C) Nivelet relative të shprehjes së miR-21 u gjetën në indet e trurit të pacientëve me tumor (N=3) dhe minjve të infektuar me Toxoplasma gondii (strajoni ME49) (N=3). *P < 0.05 u përftua me testin e Studentit. *P < 0.05 u përftua me testin e Studentit. *P < 0,05 было получено со помош t-критерия Стьюдента. *P <0.05 është marrë duke përdorur testin Student t. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 e përftuar duke përdorur testin e Studentit t.
Ekzozomet nga qelizat BV2 të infektuara me RH çuan në rritjen e gliomave in vivo dhe in vitro (Fig. 2, 3).Për të zbuluar mARN-të përkatëse, ne ekzaminuam nivelet e mRNA të gjeneve të synuara antitumorale, kutinë e forkthit O1 (FoxO1), PTEN dhe vdekjen e programuar të qelizave 4 (PDCD4) në qelizat U87 të infektuara me ekzosome që rrjedhin nga BV2 ose RH BV2.Analiza bioinformatike ka treguar se disa gjene të lidhur me tumorin, duke përfshirë gjenet FoxO1, PTEN dhe PDCD4, kanë vende lidhëse miR-2121,22.Nivelet e mRNA të gjeneve të synuara antitumorale u reduktuan në ekzosomet me prejardhje nga BV2 të infektuara me RH në krahasim me ekzosomet me prejardhje nga BV2 (Fig. 5A).FoxO1 tregoi nivele të reduktuara të proteinave në ekzosomet me prejardhje nga BV2 të infektuara me RH krahasuar me ekzosomet e derivuara nga BV2 (Figura 5B).Bazuar në këto rezultate, ne mund të konfirmojmë se ekzosomet që rrjedhin nga BV2 i infektuar me RH rregullojnë gjenet anti-onkogjene, duke ruajtur rolin e tyre në rritjen e tumorit.
Ekzozomet e derivuar nga BV2 të infektuara nga toksoplazma RH nxisin shtypjen e gjeneve antitumorale në qelizat e gliomave U87 nga ekzosomet e derivuar nga BV2 të infektuara nga Toxoplasma RH.(A) PCR në kohë reale e shprehjes së FoxO1, PTEN dhe PDCD4 në ekzosome që rrjedhin nga BV2 i infektuar me RH T. gondii krahasuar me ekzosomet PBS.Si kontroll u përdor mRNA i β-aktinës.(B) Shprehja e FoxO1 u përcaktua nga Western blotting dhe të dhënat e densitometrisë u vlerësuan statistikisht duke përdorur programin ImageJ. *P < 0.05 u përftua me testin e Studentit. *P < 0.05 u përftua me testin e Studentit. *P < 0,05 было получено со помош t-критерия Стьюдента. *P <0.05 është marrë duke përdorur testin Student t. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 e përftuar duke përdorur testin e Studentit t.
Për të kuptuar efektin e miP-21 në ekzosome në rregullimin e gjenit të lidhur me tumorin, qelizat U87 u transfektuan me një frenues të miP-21 duke përdorur Lipofectamine 2000 dhe qelizat u grumbulluan 24 orë pas transfektimit.Nivelet e shprehjes së FoxO1 dhe p27 në qelizat e transfektuara me frenues miR-21 u krahasuan me qelizat e trajtuara me ekzosome të derivuara nga BV2 duke përdorur qRT-PCR (Fig. 6A,B).Transfeksioni i frenuesit miR-21 në qelizat U87 uli ndjeshëm shprehjen e FoxO1 dhe p27 (Fig. 6).
MiP-21, i infektuar me RH, egzozomale me prejardhje nga BV2, ndryshoi shprehjen e FoxO1/p27 në qelizat glioma U87.Qelizat U87 u transfektuan me frenues miP-21 duke përdorur Lipofectamine 2000 dhe qelizat u grumbulluan 24 orë pas transfektimit.Nivelet e shprehjes së FoxO1 dhe p27 në qelizat e transfektuara me frenues miR-21 u krahasuan me nivelet në qelizat e trajtuara me ekzosome të derivuara nga BV2 duke përdorur qRT-PCR (A, B).
Për t'i shpëtuar përgjigjes imune të bujtësit, paraziti Toxoplasma transformohet në një kist ind.Ata parazitojnë inde të ndryshme, duke përfshirë trurin, zemrën dhe muskujt skeletorë, gjatë gjithë jetës së bujtësit dhe modulojnë përgjigjen imune të bujtësit.Përveç kësaj, ato mund të rregullojnë ciklin qelizor dhe apoptozën e qelizave pritëse, duke nxitur përhapjen e tyre14,24.Toxoplasma gondii infekton kryesisht qelizat dendritike të bujtësit, neutrofilet dhe linjën e monociteve/makrofagëve, duke përfshirë mikroglinë e trurit.Toxoplasma gondii nxit diferencimin e makrofagëve të fenotipit M2, ndikon në shërimin e plagëve pas infeksionit patogjen dhe shoqërohet gjithashtu me hipervaskularizimin dhe fibrozën granulomatoze.Kjo patogjenezë e sjelljes së infeksionit me Toxoplasma mund të lidhet me shënuesit që lidhen me zhvillimin e tumorit.Mjedisi armiqësor i rregulluar nga Toxoplasma mund të ngjajë me parakancerin përkatës.Prandaj, mund të supozohet se infeksioni me Toxoplasma duhet të kontribuojë në zhvillimin e tumoreve të trurit.Në fakt, nivele të larta të infeksionit me Toxoplasma janë raportuar në serumin e pacientëve me tumore të ndryshme të trurit.Përveç kësaj, Toxoplasma gondii mund të jetë një tjetër efekt kancerogjen dhe të veprojë në mënyrë sinergjike për të ndihmuar kancerogjenët e tjerë infektivë të zhvillojnë tumoret e trurit.Në këtë drejtim, vlen të theksohet se P. falciparum dhe virusi Epstein-Barr kontribuojnë në mënyrë sinergjike në formimin e limfomës Burkitt.
Roli i ekzosomeve si rregullatorë në fushën e kërkimit të kancerit është hetuar gjerësisht.Megjithatë, roli i ekzosomeve midis parazitëve dhe bujtësve të infektuar mbetet i kuptuar keq.Deri më tani, rregullatorë të ndryshëm, duke përfshirë proteinat e sekretuara, kanë shpjeguar proceset biologjike me të cilat parazitët protozoar i rezistojnë sulmit të bujtësit dhe përjetësojnë infeksionin.Kohët e fundit, ka pasur një koncept në rritje që mikrovezikulat e lidhura me protozoarët dhe mikroARN-të e tyre ndërveprojnë me qelizat pritëse për të krijuar një mjedis të favorshëm për mbijetesën e tyre.Prandaj, nevojiten studime të mëtejshme për të zbuluar marrëdhënien midis miRNA-ve ekzosomale të ndryshuara dhe përhapjes së qelizave glioma.Ndryshimi i mikroARN-së (gjenet e grupit miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 dhe miR-17-92) lidhet me promotorin STAT3 në makrofagët njerëzorë të infektuar me toksoplazmë, rregullohet dhe indukton anti -apoptoza si përgjigje ndaj infeksionit me Toxoplasma gondii 29 .Infeksioni me toksoplazmë rrit shprehjen e miR-17-5p dhe miR-106b-5p, të cilat shoqërohen me disa sëmundje hiperproliferative 30 .Këto të dhëna sugjerojnë se miRNA-të e bujtësit të rregulluara nga infeksioni me Toxoplasma janë molekula të rëndësishme për mbijetesën dhe patogjenezën e parazitëve në sjelljen biologjike të bujtësit.
MiRNA-të e ndryshuara mund të ndikojnë në lloje të ndryshme të sjelljes gjatë fillimit dhe përparimit të qelizave malinje, duke përfshirë gliomat: vetë-mjaftueshmëria e sinjaleve të rritjes, pandjeshmëria ndaj sinjaleve frenuese të rritjes, evazioni i apoptozës, potenciali i pakufizuar replikues, angiogjeneza, pushtimi dhe metastaza dhe inflamacioni.Në glioma, miRNA të ndryshuara janë identifikuar në disa studime të profilizimit të shprehjes.
Në studimin aktual, ne konfirmuam nivele të larta të shprehjes së miRNA-21 në qelizat pritëse të infektuara me toksoplazmë.miR-21 është identifikuar si një nga mikroARN-të e mbishprehura më të shpeshta në tumoret e ngurta, duke përfshirë gliomat, 33 dhe shprehja e tij lidhet me shkallën e gliomës.Dëshmitë e grumbulluara sugjerojnë se miR-21 është një onkogjen i ri që vepron si një faktor anti-apoptotik në rritjen e gliomës dhe është shumë i mbishprehur në inde dhe plazmë të tumoreve malinje të trurit të njeriut.Është interesante se inaktivizimi i miR-21 në qelizat dhe indet e gliomës shkakton frenimin e përhapjes së qelizave për shkak të apoptozës së varur nga kaspase.Analiza bioinformatike e objektivave të parashikuara të miR-21 zbuloi gjene të shumta supresore të tumorit të lidhur me rrugët e apoptozës, duke përfshirë vdekjen e programuar të qelizave 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN dhe kutinë e kokës O1 (FoxO1), me vendin e lidhjes miR-2121..22.38.
FoxO1, si një nga faktorët e transkriptimit (FoxO), është i përfshirë në zhvillimin e llojeve të ndryshme të kancerit njerëzor dhe mund të rregullojë shprehjen e gjeneve supresore të tumorit si p21, p27, Bim dhe FasL40.FoxO1 mund të lidhë dhe aktivizojë frenuesit e ciklit qelizor si p27 për të shtypur rritjen e qelizave.Për më tepër, FoxO1 është një efekt kyç i sinjalizimit PI3K/Akt dhe rregullon shumë procese biologjike si progresi i ciklit qelizor dhe diferencimi i qelizave përmes aktivizimit të transkriptimit të p2742.
Si përfundim, ne besojmë se miR-21 ekzosomal që rrjedh nga mikroglia e infektuar me Toksoplazmë mund të luajë një rol të rëndësishëm si rregullator i rritjes së qelizave glioma (Fig. 7).Megjithatë, nevojiten studime të mëtejshme për të gjetur një lidhje të drejtpërdrejtë midis miR-21 ekzosomike, infeksionit të ndryshuar të Toksoplazmës dhe rritjes së gliomës.Këto rezultate pritet të ofrojnë një pikënisje për studimin e marrëdhënies midis infeksionit me Toxoplasma dhe incidencës së glioma.
Në këtë studim propozohet një diagram skematik i mekanizmit të kancerogjenezës së gliomes (trurit).Autori vizaton në PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Të gjitha protokollet eksperimentale në këtë studim, duke përfshirë përdorimin e kafshëve, ishin në përputhje me Udhëzimet Etike Standarde të Kujdesit për Kafshët dhe Komitetit të Përdoruesit të Universitetit Kombëtar të Seulit dhe u miratuan nga Bordi i Rishikimit Institucional të Shkollës Kombëtare të Mjekësisë të Universitetit të Seulit (numri IRB SNU- 150715).-2).Të gjitha procedurat eksperimentale u kryen në përputhje me rekomandimet e ARRIVE.
Mikroglia e miut BV2 dhe qelizat e gliomës njerëzore U87 u kultivuan në Mediumin e Modifikuar të Shqiponjës Dulbecco (DMEM; Welgene, Seul, Kore) dhe Mediumin e Institutit Memorial Roswell Park (RPMI; Welgene), secila që përmbante 10% serum fetusi gjedhit, 4 mMl- glutaminë, 0,2 mM penicilinë dhe 0,05 mM streptomicinë.Qelizat u kultivuan në një inkubator me 5% CO2 në 37°C.Një linjë tjetër qelizore glioma, U118, u përdor për krahasim me qelizat U87.
Për të izoluar ekzosome nga shtamet RH dhe ME49 të infektuar me T. gondii, takizoitet e T. gondii (shtam RH) u morën nga zgavra e barkut të minjve BALB/c 6 javësh të injektuara 3-4 ditë më parë.Takizoitët u lanë tre herë me PBS dhe u pastruan me centrifugim në 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Për të marrë takizoitet e shtamit ME49, minjve BALB/c u injektuan në mënyrë intraperitoneale 20 kiste indore dhe transformimi i takizoitit në kiste u mblodh duke larë zgavrën e barkut në ditën e 6-8 pas infektimit (PI).Minjtë e infektuar me PBS.Takizoitët ME49 u rritën në qeliza të plotësuara me 100 μg/ml penicilinë (Gibco/BRL, Grand Island, NY, SHBA), 100 μg/ml streptomicinë (Gibco/BRL) dhe 5% serum të fetusit të gjedhit (Lonza, Walkersville, MD) .., SHBA) në 37 °C dhe 5% dioksid karboni.Pas kultivimit në qelizat Vero, takizoitët ME49 u kaluan dy herë përmes një gjilpëre me matës 25 dhe më pas përmes një filtri 5 μm për të hequr mbeturinat dhe qelizat.Pas larjes, takizoitët u risuspenduan në PBS44.Kistet indore të shtamit ME49 Toxoplasma gondii u mbajtën me injeksion intraperitoneal të kisteve të izoluara nga truri i minjve të infektuar C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Truri i minjve të infektuar me ME49 u korr pas 3 muajsh PI dhe u gris nën një mikroskop për të izoluar cistat.Minjtë e infektuar u mbajtën në kushte të veçanta pa patogjen (SPF) në Shkollën Kombëtare të Mjekësisë të Universitetit të Seulit.
ARN totale u nxor nga ekzosome të derivuara nga BV2, qeliza dhe inde BV2 duke përdorur paketën miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Gjermani) sipas udhëzimeve të prodhuesit, duke përfshirë kohën e inkubacionit për hapin e elucionit.Përqendrimi i ARN-së u përcaktua në një spektrofotometër NanoDrop 2000.Cilësia e mikrovargjeve të ARN-së u vlerësua duke përdorur një bianalizues Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holandë).
DMEM me 10% FBS të varfër në ekzosome u përgatit me ultracentrifugim në 100,000 g për 16 orë në 4°C dhe u filtua përmes një filtri 0.22 μm (Nalgene, Rochester, NY, SHBA).Qelizat BV2, 5 × 105, u kultivuan në DMEM që përmban 10% FBS të varfëruar nga ekzosome dhe 1% antibiotikë në 37°C dhe 5% CO2.Pas 24 orësh inkubimi, takizoitet e shtamit RH ose ME49 (MOI = 10) u shtuan në qeliza dhe parazitët jo pushtues u hoqën brenda një ore dhe u rimbushën me DMEM.Ekzozomet nga qelizat BV2 u izoluan me centrifugim diferencial të modifikuar, metoda më e përdorur.Risuspendoni peletin ekzosome në 300 µl PBS për analizën e ARN-së ose proteinave.Përqendrimi i ekzosomeve të izoluara u përcaktua duke përdorur një kit analize të proteinave BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) dhe një spektrofotometër NanoDrop 2000.
Precipitatet nga qelizat BV2 ose ekzosomet që rrjedhin nga BV2 u lizuan në tretësirën e ekstraktimit të proteinës PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) dhe proteinat u ngarkuan në xhel poliakrilamid 10% SDS me njolla blu të shkëlqyer Coomassie.Përveç kësaj, proteinat u transferuan në membranat PVDF për 2 orë.Njollat ​​Western u vërtetuan duke përdorur antitrupin Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) si një shënues ekzosomal.Si një antitrup dytësor u përdorën IgG anti-mish dhie e konjuguar me HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) dhe një analizues imazhi luminescent LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokio, Japoni)..Mikroskopi elektronik transmetues u krye për të studiuar madhësinë dhe morfologjinë e ekzosomeve.Ekzozomet e izoluara nga qelizat BV2 (6.40 µg/µl) u përgatitën në rrjeta të veshura me karbon dhe u ngjyrosën negativisht me 2% acetat uranil për 1 min.Mostrat e përgatitura u vëzhguan në një tension përshpejtues prej 80 kV duke përdorur një JEOL 1200-EX II (Tokio, Japoni) të pajisur me një kamerë CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Ekzozomet e derivuar nga BV2 u ngjyrosën duke përdorur PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) për 15 minuta në temperaturën e dhomës.Qelizat U87, 2×105, me ekzosome të etiketuara me PKH26 (të kuqe) ose pa ekzosome si kontroll negativ, u inkubuan në 37°C për 24 orë në një inkubator 5% CO2.Bërthamat e qelizave U87 u ngjyrosën me DAPI (blu), qelizat U87 u fiksuan në 4% paraformaldehid për 15 minuta në 4°C dhe më pas u analizuan në një sistem mikroskopi konfokal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Gjermani).të vëzhgueshme.
cDNA u sintetizua nga siRNA duke përdorur sintezën e vargut të parë të Mir-X siRNA dhe kitin SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japoni).PCR sasiore në kohë reale u krye duke përdorur sistemin e zbulimit të PCR në kohë reale iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) duke përdorur primerë dhe shabllone të përzier me SYBR Premix.ADN-ja u përforcua për 40 cikle denatyrimi në 95°C për 15 s dhe pjekje në 60°C për 60 s.Të dhënat nga çdo reagim PCR u analizuan duke përdorur modulin e analizës së të dhënave të softuerit të sistemit optik iQ™5 (Bio-Rad).Ndryshimet relative në shprehjen e gjeneve midis gjeneve të përzgjedhura të synuara dhe β-aktinës/siRNA (dhe U6) u llogaritën duke përdorur metodën e kurbës standarde.Sekuencat e primerit të përdorura janë paraqitur në Tabelën 1.
3 x 104 qeliza glioma U87 u mbollën në pllaka 96 pusesh dhe u përzien me ekzosome të infektuara me Toksoplazmë që rrjedhin nga BV2 (50 μg/mL) ose ekzosome jo pulsuese që rrjedhin nga BV2 (50 μg/mL) si kontrolle në 12, 18 dhe 36 orë. .Shkalla e përhapjes së qelizave u përcaktua duke përdorur Kompletin e Numërimit të Qelizave-8 (Dojindo, Kumamoto, Japoni) (Figura Suplementare S1-S3) 46 .
Minj nudo femra BALB/c 5 javësh u blenë nga Orient Bio (Seongnam-si, Koreja e Jugut) dhe u mbajtën individualisht në kafaze sterile në temperaturën e dhomës (22±2°C) dhe lagështinë (45±15°C).%) në temperaturën e dhomës (22±2°C) dhe lagështinë (45±15%).Një cikël drite 12-orësh dhe një cikël 12-orësh të errët u kryen nën SPF (Qendra Kombëtare e Kafshëve të Shkollës së Mjekësisë të Universitetit të Seulit).Minjtë u ndanë në mënyrë të rastësishme në tre grupe me nga 5 minj secili dhe të gjitha grupeve iu injektuan në mënyrë subkutane 400 ml PBS që përmbante 1 x 107 qeliza glioma U87 dhe faktorin e rritjes të reduktuar BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Gjashtë ditë pas injektimit të tumorit, 200 mg ekzosome që rrjedhin nga qelizat BV2 (me/pa infeksion Toxoplasma) u injektuan në vendin e tumorit.Njëzet e dy ditë pas infektimit të tumorit, madhësia e tumorit të minjve në secilin grup u mat me një kaliper tre herë në javë dhe vëllimi i tumorit u llogarit me formulën: 0.5×(gjerësi)×2×gjatësi.
Analiza e shprehjes së MicroRNA duke përdorur grupin miRCURYTM LNA miRNA, gjenerata e 7-të ka, vargje mmu dhe rno (EXIQON, Vedbaek, Danimarkë) që mbulojnë 1119 minj të mirë-karakterizuar midis 3100 sondave të kapjes së miRNA të njeriut, miut dhe miut.Gjatë kësaj procedure, 250 deri në 1000 ng të ARN-së totale u hoqën nga 5'-fosfati nëpërmjet trajtimit me fosfatazë alkaline të zorrëve të viçit, e ndjekur nga etiketimi me ngjyrë fluoreshente jeshile Hy3.Mostrat e etiketuara më pas u hibridizuan duke ngarkuar rrëshqitës me mikroarresë duke përdorur një komplet të dhomës së hibridizimit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SHBA) dhe një çantë rrëshqitëse hibridizimi (Agilent Technologies).Hibridizimi u krye për 16 orë në 56°C, më pas mikrovargjet u lanë në përputhje me rekomandimet e prodhuesit.Diapozitivët e përpunuar të mikrovargut u skanuan më pas duke përdorur një sistem skaneri mikrovargu Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Imazhet e skanuara u importuan duke përdorur versionin 10.7.3.1 të softuerit Agilent Feature Extraction (Agilent Technologies) dhe intensiteti i fluoreshencës i çdo imazhi u mat duke përdorur skedarin përkatës GAL të protokollit të modifikuar Exiqon.Të dhënat e mikroarresë për studimin aktual janë depozituar në bazën e të dhënave GEO me numrin e hyrjes GPL32397.
Profilet e shprehjes së miRNA-ve ekzosomale të pjekura në mikroglia të shtameve RH ose ME49 të infektuar me Toxoplasma u analizuan duke përdorur mjete të ndryshme rrjeti.MiRNA-të e lidhura me zhvillimin e tumorit u identifikuan duke përdorur miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) dhe u filtruan me intensitet të normalizuar të sinjalit (log2) më të madh se 8.0.Midis miRNA-ve, miRNA-të e shprehura në mënyrë diferenciale u gjetën të jenë më shumë se 1.5 herë të ndryshuara nga analiza e filtrit të miRNA-ve të ndryshuara nga shtamet RH ose ME49 të infektuar me T. gondii.
Qelizat u mbollën në pllaka me gjashtë pus (3 x 105 qeliza/pus) në opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) duke përdorur Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Qelizat e transfektuara u kultivuan për 6 orë dhe më pas mjedisi u ndryshua në mjedis të freskët të plotë.Qelizat u grumbulluan 24 orë pas transfektimit.
Analiza statistikore është kryer kryesisht duke përdorur testin Student t-test me softuerin Excel (Microsoft, Washington, DC, SHBA).Për analizën eksperimentale të kafshëve, u krye një ANOVA me dy drejtime duke përdorur softuerin Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-vlerat < 0.05 u konsideruan si statistikisht të rëndësishme. Vlerat P < 0.05 u konsideruan statistikisht të rëndësishme. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Vlerat P <0.05 u konsideruan statistikisht të rëndësishme. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Vlerat P <0.05 u konsideruan statistikisht të rëndësishme.
Të gjitha protokollet eksperimentale të përdorura në këtë studim u miratuan nga Bordi i Rishikimit Institucional të Shkollës Kombëtare të Mjekësisë të Universitetit të Seulit (numri IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Incidenca dhe vdekshmëria e vlerësuar globale e kancerit në 2018: Burimet dhe metodat e GLOBOCAN.Interpretimi.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Një pasqyrë në faktorët e rrezikut të tumoreve të trurit dhe ndërhyrjet e tyre terapeutike. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Një pasqyrë në faktorët e rrezikut të tumoreve të trurit dhe ndërhyrjet e tyre terapeutike.Rashid, S., Rehman, K. dhe Akash, MS Një përmbledhje e faktorëve të rrezikut për tumoret e trurit dhe ndërhyrjet kryesore terapeutike. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Kuptimi i thellë i faktorëve të rrezikut të tumorit të trurit dhe ndërhyrjeve terapeutike.Rashid, S., Rehman, K. dhe Akash, MS Një përmbledhje e faktorëve të rrezikut për tumoret e trurit dhe ndërhyrjet kryesore terapeutike.Shkenca biomjekësore.Farmacist.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Ndërveprimet bakteriale-virale në kanceret e traktit gjenital orodigjestiv të njeriut dhe femëror: Një përmbledhje e provave epidemiologjike dhe laboratorike. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Ndërveprimet bakteriale-virale në kanceret e traktit gjenital orodigjestiv të njeriut dhe femëror: Një përmbledhje e provave epidemiologjike dhe laboratorike.Kato I., Zhang J. dhe Sun J. Ndërveprimet bakterio-virale në kancerin e traktit gastrointestinal të njeriut dhe traktit gjenital femëror: një përmbledhje e të dhënave epidemiologjike dhe laboratorike. Kato, I., Zhang, J.& Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Ndërveprimi bakterio-viral në tretjen e zgavrës me gojë të njeriut dhe traktin riprodhues femëror: përmbledhje e shkencës së sëmundjeve popullore dhe dëshmive laboratorike.Kato I., Zhang J. dhe Sun J. Ndërveprimet bakterio-virale në kancerin gastrointestinal të njeriut dhe kancerin gjenital femëror: një përmbledhje e të dhënave epidemiologjike dhe laboratorike.Kanceri 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Nga infeksioni në kancer: Si viruset e tumorit të ADN-së ndryshojnë metabolizmin qendror të karbonit dhe lipideve të qelizës pritëse. Magon, KL & Parish, JL Nga infeksioni në kancer: Si viruset e tumorit të ADN-së ndryshojnë metabolizmin qendror të karbonit dhe lipideve të qelizës pritëse.Mahon, KL dhe Parish, JL Infeksioni nga zjarri ndaj kancerit: si viruset e tumorit të bazuar në ADN ndryshojnë karbonin qendror të qelizës pritëse dhe metabolizmin e lipideve. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Nga infeksioni te kanceri: si viruset e tumorit të ADN-së ndryshojnë karbonin qendror të qelizës pritëse dhe metabolizmin e lipideve.Mahon, KL dhe Parish, JL Shkakton infeksionin në kancer: si viruset e tumorit të ADN-së ndryshojnë metabolizmin qendror të karbonit dhe lipideve në qelizat pritëse.Biologji e hapur.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estrogjenet katekolike të shistozomeve dhe flukseve të mëlçisë dhe kancerit të lidhur me helminthin.përpara.nxehtë brenda.5, 444 (2014).