Giardia duodenum është një organizëm parazitar që shkakton giardiasis, një infeksion intestinal veçanërisht i zakonshëm tek fëmijët e vegjël me shenja klinike të diarresë.Ne kemi raportuar më parë se G. duodenalis jashtëqelizore shkakton aktivizimin e nukleotideve lidhëse të receptorit 3 (NLRP3) të ngjashëm me oligomerizimin ndërqelizor dhe rregullon përgjigjet inflamatore të bujtësit përmes sekretimit të vezikulës jashtëqelizore (EV).Sidoqoftë, modelet e sakta molekulare të EV duodenokokale të lidhur me patogjenin (GEV) të përfshirë në këtë proces dhe roli i inflamazomit NLRP3 në giardiasis mbeten për t'u sqaruar.
Plazmidet rekombinante të shprehjes eukariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 dhe giardinat alfa-7.3 në GEV u ndërtuan, u transfektuan në makrofagët parësorë peritoneal të miut dhe u zbuluan duke matur molekulën e synuar të inflamacionit kaspaz-1.Niveli i shprehjes p20 u kontrollua..G. duodenalis alfa-2 dhe alfa-7.3 giardinat fillimisht u identifikuan duke matur inflamazomin NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-kaspase-1 dhe kaspase-1 p20), sekretimin e IL.Nivelet 1β, nivelet e oligomerizimit të proteinës me pika apoptotike (ASC) dhe lokalizimi imunofluoreshent i NLRP3 dhe ASC.Roli i inflamazomës NLRP3 në patogjenitetin e G. duodenalis u vlerësua më pas duke përdorur minj në të cilët aktivizimi i NLRP3 u bllokua (minj të bllokuar nga NLRP3) dhe u monitoruan ndryshimet patologjike në peshën trupore, ngarkesën parazitare duodenale dhe indin duodenal.Përveç kësaj, ne hetuam nëse hiardinat alfa-2 dhe alfa-7.3 nxisin sekretimin e IL-1β in vivo nëpërmjet inflamazomës NLRP3 dhe përcaktuam rolin e këtyre molekulave në patogjenitetin e G. duodenalis te minjtë.
Giardinat alfa-2 dhe alfa-7.3 nxisin aktivizimin e inflamazomës NLRP3 in vitro.Kjo çoi në aktivizimin e p20 kaspase-1, një rritje në nivelet e shprehjes së proteinave NLRP3, pro-IL-1β dhe pro-kaspase-1, një rritje të konsiderueshme në sekretimin e IL-1β, formimin e njollave ASA në citoplazma, dhe induksioni i oligomerizimit të ASA.Inflamacioni i NLRP3 Humbja e penisit përkeqëson patogjenitetin e G. duodenalis te minjtë.Minjtë e trajtuar me kiste me anë të gropës nga minjtë e bllokuar me NLRP3 shfaqën një numër të shtuar trofozoitësh dhe dëmtime të rënda të vileve duodenale, të karakterizuara nga kripte nekrotike me tkurrje dhe degëzime.Eksperimentet in vivo kanë treguar se giardinat alfa-2 dhe alfa-7.3 mund të nxisin sekretimin e IL-1β nëpërmjet inflamazomës NLRP3 dhe imunizimi me giardina alfa-2 dhe alfa-7.3 reduktoi patogjenitetin e G. duodenalis te minjtë.
Të marra së bashku, rezultatet e këtij studimi sugjerojnë se giardia alfa-2 dhe alfa-7.3 shkaktojnë rregullim të lartë të inflamacionit të NLRP3 të bujtësit dhe reduktojnë infektivitetin e G. duodenalis te minjtë, të cilët janë objektiva premtues për parandalimin e giardiasis.
Giardia duodenum është një parazit protozoar jashtëqelizor që jeton në zorrën e hollë dhe shkakton 280 milionë raste të giardiasis me diarre çdo vit, veçanërisht tek fëmijët e vegjël në vendet në zhvillim [1].Njerëzit infektohen nga uji i pijshëm ose ushqimi i kontaminuar me kistet M. duodenum, të cilat më pas hyjnë në stomak dhe ekskretohen në lëngjet gastrike.Trofozoitët Giardia duodenum ngjiten në epitelin duodenal, duke shkaktuar nauze, të vjella, diarre, dhimbje barku dhe humbje peshe.Individët me mungesë imuniteti dhe fibrozë cistike janë të ndjeshëm ndaj infeksionit.Infeksioni mund të ndodhë edhe nëpërmjet seksit oral dhe anal [2].Barnat si metronidazoli, tinidazoli dhe nitazoxanide janë opsionet e preferuara të trajtimit për infeksionet duodenale [3].Sidoqoftë, këto barna të kimioterapisë shkaktojnë efekte anësore të padëshiruara si nauze, kancerogjenezë dhe gjenotoksicitet [4].Prandaj, duhet të zhvillohen strategji më efektive për të parandaluar infeksionin G. duodenalis.
Inflamazomet janë një klasë e komplekseve të proteinave citosolike që janë pjesë e përgjigjes imune të lindur, duke ndihmuar në mbrojtjen kundër pushtimit patogjen dhe ndërmjetësojnë përgjigjet inflamatore [5].Midis këtyre inflamazomeve, receptori 3 (NLRP3) i oligomerizimit me lidhjen e nukleotideve (NLRP3) i ngjashëm me lidhjen e nukleotideve (NLRP3) është studiuar gjerësisht sepse mund të zbulohet nga patogjene të ndryshme/modele të lidhura me dëmtimin (PAMP molekulare/modele të lidhura me dëmtimin). DAMP), njeh, aktivizon sistemin imunitar të lindur.dhe rregullon homeostazën e zorrëve në shumë sëmundje inflamatore [6,7,8].Ai përbëhet nga receptori i njohjes së modelit (PRR) NLRP3, një proteinë me njolla apoptotike përshtatëse (ASC) dhe një efektor prokaspase-1 ose prokaspase-11.Inflamazoma NLRP3 vepron si një bujtës kundër pushtimit të patogjenit, siç vërehet në studimet e Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] dhe Leishmania.[11], por është raportuar gjithashtu se aktivizimi i inflamatorit NLRP3 kufizon përgjigjet mbrojtëse imune dhe përkeqëson përparimin e sëmundjes, për shembull, te krimbat [12].Bazuar në gjetjet tona të mëparshme, ne raportuam se G. duodenalis jashtëqelizore shkakton aktivizimin ndërqelizor të inflamacionit NLRP3 dhe modulon përgjigjet inflamatore të bujtësit duke sekretuar vezikula jashtëqelizore (EVs) [13].Megjithatë, roli i inflamazomit NLRP3 në infeksionin in vivo të G. duodenalis mbetet për t'u përcaktuar.
Giardinat fillimisht u përshkruan si përbërës strukturorë të citoskeletit G. duodenalis dhe luajnë një rol të rëndësishëm në lëvizshmërinë e trofozoitëve dhe ngjitjen e qelizave epiteliale në zorrën e hollë.Për t'u përshtatur më mirë me mjedisin dhe për të rritur patogjenitetin e tyre, trofozoitët G. duodenalis zhvilluan një strukturë unike citoskeletore të përbërë nga 8 flagjela, 1 trup i mesëm dhe 1 disk ventral [14].Trofozoitët e Giardia duodenum përdorin citoskeletin e tyre për të depërtuar në pjesën e sipërme të zorrës së hollë, veçanërisht në duoden, dhe për t'u bashkuar me enterocitet.Ata vazhdimisht migrojnë dhe ngjiten në qelizat epiteliale duke përdorur metabolizmin qelizor.Prandaj, ekziston një lidhje e ngushtë midis citoskeletit të tyre dhe virulencës.Giardinat specifike për Giardia duodenum janë përbërës të strukturës së citoskeletit [15] dhe ndahen në katër klasa: α-, β-, γ- dhe δ-giardina.Ka 21 anëtarë të familjes α-giardin, të cilët të gjithë kanë një aftësi të varur nga kalciumi për të lidhur fosfolipidet [16].Ata gjithashtu lidhin citoskeletin me membranën qelizore.Në individët me diarre të shkaktuar nga G. duodenalis, α-giardinat janë shumë të shprehura dhe imunoreaktive gjatë infeksionit [17].Vaksinat heterologe të bazuara në Giardia alfa-1 mbrojnë kundër giardiasis në minj dhe janë antigjenë potencialë kandidatë për zhvillimin e vaksinës [18].Giardin alfa-8, i lokalizuar në membranën plazmatike dhe flagjelë, por jo në diskun ventral, rrit lëvizshmërinë dhe shpejtësinë e rritjes së trofozoiteve në G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin ngjitet në strukturat e mikrotubulave në flagjelë dhe ndikon në qëndrueshmërinë e G. duodenalis [20].Alfa-11 giardina është e pranishme me bollëk gjatë gjithë ciklit jetësor dhe mbishprehja e alfa-11 giardine dëmton vetë G. duodenalis [21].Megjithatë, është e paqartë nëse alfa-2 giardina dhe alfa-7.3 giardina janë mbrojtëse ndaj infeksionit G. duodenalis dhe mekanizmave të tyre themelorë.
Në këtë studim, plazmidet rekombinante të shprehjes eukariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine dhe pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina u transfektuan në makrofagët primare peritoneale të miut për të aktivizuar NLRP3 të bujtësit.Objektivat inflamatore më pas u ekzaminuan.Ne vlerësuam gjithashtu rolin e inflamazomës NLRP3 në patogjenitetin e G. duodenalis, hetuam nëse giardinat alfa-2 dhe alfa-7,3 nxisin aktivizimin e inflamazomës NLRP3 in vivo dhe përcaktuam se këto dy role të giardinave në patogjenitetin e G. duodenalis.Qëllimi ynë i përbashkët ishte të zhvillonim objektiva premtues për parandalimin e infeksionit G. duodenalis.
Minj femra të tipit të egër (WT) C57BL/6 të moshës 5-8 javësh u blenë nga Qendra Eksperimentale e Kafshëve Liaoning Changsheng (Liaoning, Kinë).Minjtë kishin qasje të lirë në ujë, morën ushqim të sterilizuar dhe u mbajtën në një cikël dritë/errësi 12/12 orë.Përpara infektimit, minjtë morën antibiotikë ad libitum në ujë të pijshëm të plotësuar me ampicilinë (1 mg/mL), vankomicinë (1 mg/mL) dhe neomicinë (1.4 mg/mL) (të gjithë të blerë nga Shanghai, Kinë, organizma artificialë) [22 ].].Minjtë që humbën aftësinë për të ngrënë dhe pirë për > 24 orë dhe humbën ≥ 20% peshë trupore u eutanizuan në mënyrë njerëzore nga dislokimi i qafës së mitrës.
Trofozoitët WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) u plotësuan me 12.5% ​​serum të fetusit të gjedhit (FBS; Every Green, Zhejiang, Kinë) dhe 0.1% biliare të gjedhit (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).SHBA) në kushte mikroaerobike.Trofozoitët e bashkuar u mblodhën në akull dhe u kaluan në një raport prej 1:4 për riprodhim të mëtejshëm.
Kistet Giardia duodenum u induktuan siç u përshkrua më parë [23], trofozoitët u grumbulluan në fazën logaritmike dhe më pas u holluan me mjedis induktues të kapsulimit, pH 7.1 (TYI-S-33 i modifikuar) në një përqendrim përfundimtar prej 1 × 106 trofozoite/mL.koncentrimi biliar 0.05% mesatar).Trofozoitët u kultivuan në kushte anaerobe në 37°C deri në fazën e rritjes logaritmike.Ndryshoni mjedisin në mjedis nxitës të kistit (pH 7.8; mjedis i modifikuar TYI-S-33 me përqendrim biliar 1%) dhe kultivoni G. duodenalis në 37°C për 48-96 orë, gjatë së cilës kistet e formimit u vëzhguan nën një mikroskop.Pasi shumica e trofozoitëve ishin nxitur për të formuar kiste, përzierja e kulturës u korr dhe u risuspendua në ujë steril të deionizuar për të lizuar trofozoitët e mbetur.Kistet u numëruan dhe u ruajtën në 4°C për analiza të mëvonshme përmes një tubi gastrik te minjtë.
Vezikulat jashtëqelizore Giardia (GEVs) u pasuruan siç përshkruhet më parë [13].Trofozoitët në fazën e rritjes logaritmike u risuspenduan në mjedisin e modifikuar TYI-S-33 të përgatitur me FBS të varfëruar nga ekzosome (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) në një përqendrim përfundimtar prej 1 × 106 parazitë/mL dhe u inkubuan për 12 orë.u izoluan nga supernatanti i kulturës me centrifugim në 2000 g për 10 min, 10,000 g për 45 min dhe 100,000 g për 60 min.Precipitatet u tretën në kripë të kripur të izoluar me fosfat (PBS), u përcaktuan në sasi duke përdorur një komplet të analizës së proteinës BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dhe u ruajtën në -80° C. ose u përdorën drejtpërdrejt për analiza të mëtejshme.
Makrofagët primare peritoneale të miut u përgatitën siç përshkruhet më parë [24].Shkurtimisht, minjtë (të moshës 6-8 javë) u injektuan (intraperitonealisht [ip]) me 2,5 ml medium tioglikoli të lëngshëm 2,98% Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) dhe u ushqyen 3-4 qiellza.Një suspension makrofagësh u mblodh nga zgavra e barkut të minjve pas eutanazisë dhe u centrifugua 3 herë në 1000 g për 10 minuta.Qelizat e mbledhura u zbuluan me citometri të rrjedhës duke përdorur shënuesin CD11b derisa pastërtia e qelizave ishte >98%, më pas u shtuan në pllakat e kulturës së qelizave me 6 pus (4,5 x 106 qeliza/pus) dhe u inkubuan me 10% FBS (Bioindustry) në 37°C.dhe 5% CO2.
ARN u nxor nga 1 × 107 trofozoite në 1 ml reagent TRIzol (Vazyme, Nanjing, Kinë), ADN gjenomike u nxor nga ARN totale e G. duodenalis duke përdorur MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kinë) dhe u sintetizua ADN plotësuese (cDNA). duke përdorur MonScript RTIIII Super Mix (Monad) sipas udhëzimeve të prodhuesit.
Informacioni i sekuencës CDS për gjenin e synuar G. duodenalis u mor nga GenBank NCBI.Përdorni Primer 5.0 për të hartuar primerë specifikë të klonimit pa probleme për çdo gjen të synuar.Abetarja e përparme (5'-3') përbëhet nga tre pjesë: një sekuencë e mbivendosur me një vektor të linearizuar pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) dhe kodonet fillestare ATG dhe GNN (nëse baza e parë nuk është G).Kjo është bërë për të përmirësuar efikasitetin e shprehjes.Përveç kësaj, të paktën 16 bp baza të kombinuara (përmbajtja GC 40–60%/Tm përafërsisht 55 °C).Abetarja e kundërt (5'-3') përbëhet nga dy pjesë, një sekuencë e mbivendosur me një vektor pcDNA3.1(+) të linearizuar nga EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) dhe një bazë e kombinuar prej të paktën 16 bp.(duke përjashtuar dy ndalesat e fundit).bazat) një kodon si AA ose GA për të lejuar plazmidet rekombinante të shprehin proteinat e tyre të etiketuara).Sekuencat e primerit janë renditur në Tabelën 1 dhe janë sintetizuar nga Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kinë).
Objektivat u përforcuan duke përdorur polimerazën e ADN-së Pfu (Tiangen, Pekin, Kinë) ose Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekin, Kinë) duke përdorur cDNA të përgatitur të G. duodenalis si shabllon.Plazmidi i vektorit të shprehjes eukariote pcDNA3.1(+) u linearizua me enzimën kufizuese EcoRV dhe u defosforilua duke përdorur Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Fragmentet e linearizuara të pcDNA3.1 (+) dhe fragmentet e gjenit të synuar të amplifikuar u pastruan duke përdorur një kit për pastrimin e xhelit të ADN-së (Tiangen) dhe u matën duke përdorur një Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragmenti pcDNA3.1 (+) dhe secili fragment i gjenit të synuar u rikombinuan duke përdorur përzierjen e klonimit të montimit të vetëm MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kinë) dhe u konfirmuan nga sekuenca e ADN-së duke përdorur Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kinë)..
Plazmidet pa endotoksina pcDNA3.1(+)-alfa-2 dhe pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 u krijuan duke përdorur SanPrep-Pa Endotoksina Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Përqendrimi u mbajt mbi 500 ng/µl për të siguruar që EDTA në tampon elucioni nuk ndërhynte në analizën e transfeksionit.Makrofagët parësorë peritoneal të miut u kultivuan në pllaka 6 pusesh me mjedis të plotë RPMI 1640 (Industri Biological) për 12 orë, më pas qelizat u lanë 3 herë në PBS të ngrohtë për të hequr penicilinën dhe streptomicinën, dhe më pas në mjedis të plotësuar me mjedis të plotë.Plazmidet pa endotoksina pcDNA3.1(+)-alfa-2 dhe pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2.5 μg) u holluan në 125 μl medium serumi të reduktuar Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Më pas 5 µl të reagentit transfektues Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) u hollua në 125 µl medium Opti-MEM me serum të ulët.Përgatitni komplekset liposome-ADN duke përzier plazmidin e holluar pa endotoksina me Lipofectamine 2000 dhe duke e lënë përzierjen të qëndrojë në temperaturën e dhomës për 5 minuta.Transferoni komplekset veçmas në qelizat në secilën pus dhe përzieni ngadalë.Pas 4 orësh, mjedisi i kulturës qelizore u zëvendësua me 2 ml medium të plotë RPMI 1640 dhe kultivimi vazhdoi për 24 orë.Mjeti i freskët i kulturës së qelizave u shtua në qeliza dhe u inkubua për pika të ndryshme kohore në varësi të modelit të analizës.
Mostrat e proteinave nga supernatantët dhe lizatat e qelizave u përgatitën siç përshkruhet më parë [25].Parametrat e transferimit të membranës për pro-IL-1β, pro-kaspase-1, kaspase-1 p20, NLRP3, β-aktin dhe His-tag ishin 200 mA/90 min.Për interleukinën 1β (IL-1β; Sistemet R&D, Minneapolis, Minesota, SHBA), kaspase-1 (p20) (Adipogen, Zvicër) dhe NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Zvicër) dhe 1:5000 duke synuar etiketën e tij ( Amylet Scientific, Wuhan, Kinë) dhe β-aktinë (Proteintech, Wuhan, Kinë).
Lidhja e kryqëzuar me suberatin diskcinimid (DSS) u krye siç përshkruhet më parë [26].Qelizat u lanë 3 herë me PBS të ftohtë dhe u lizuan plotësisht me një gjilpërë me matës 27 në 50 µl tampon reaksioni ASC (pH 8.0) që përmban 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES dhe 125 mM NaHCO3.Përzierja u centrifugua në 5000 g për 3 minuta dhe peleti u qep me 10 µl DSS (25 mM në DMSO) dhe 40 µl tampon reaksioni ASC për 30 minuta në 37°C.Pas centrifugimit në 5000 g për 10 min, peleti u shpërnda në një tretësirë ​​prej 40 μl të tamponit të reagimit ASC dhe 10 μl të tamponit të ngarkimit të proteinave 6x (TransGen, Pekin, Kinë), dhe më pas tretësira u shua në temperaturën e dhomës për 15 orë. min., Më pas ziejini 10 minuta.Mostrat e proteinave më pas iu nënshtruan Western blotting duke përdorur antitrupa primar anti-ASC (Wanleibio, Shenyang, Kinë) në një raport hollimi prej 1:500.
Pas një procedure të përshkruar më parë [13], supernatantët e kulturës qelizore u grumbulluan dhe sekretimi i citokinës pro-inflamatore IL-1β u përcaktua duke përdorur kitin IL-1 Beta ELISA të miut (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konvertoni vlerat e OD450nm në përqendrimet e proteinave duke përdorur kurbën standarde IL-1β.
Qelizat e veshura me mbulesa u lanë butësisht 3 herë në PBS të ngrohtë, të fiksuara në fiksues të qelizave indore (Biosharp, Pekin, Kinë) për 10 minuta në temperaturën e dhomës (RT), në 0.1% Triton X-Permeabilize në 100 (i holluar në PBS; Biosharp ) për 20 minuta në temperaturën e dhomës dhe bllokohet në albuminën e serumit të gjedhit 5% (në PBS) për 2 orë në temperaturën e dhomës.Më pas qelizat u inkubuan gjatë natës në 4°C me antitrupa parësorë kundër ASC (hollimi 1:100) ose NLRP3 (hollimi 1:100), përkatësisht, dhe IgG (H+L) kundër dhisë kundër lepurit të etiketuar me Cy3 (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) ose IgG anti-miu i konjuguar me FITC (1:400; Earthox) gjatë natës në 37°C në errësirë ​​për 1 orë.Bërthamat u ngjyrosën me Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kinë) për 5 minuta dhe u vëzhguan nën një mikroskop fluoreshent (Olympus Corporation, Tokio, Japoni).
Minjtë u ndanë në katër grupe (n = 7 në secilin grup): (i) grupi i kontrollit negativ i trajtuar me PBS (vetëm PBS; 100 μl/miu PBS i ndjekur nga injeksioni ditor intraperitoneal 100 μl/PBS për miun 3 orë më vonë)., vazhdimisht për 7 ditë);(ii) grupi i kontrollit negativ i trajtuar me frenues MCC950 [27] (100 μl/miu nëpërmjet kanalit PBS, 3 orë më vonë, 10 mg/kg peshë trupore [BW] MCC950 [në PBS] u administrua në mënyrë intraperitoneale çdo ditë, kohëzgjatja 7 ditë);(iii) grupi i infeksionit me kist G. duodenalis (1,5 x 106 kiste/miu me gavazh, 3 orë më vonë, 100 μl/mi PBS intraperitonealisht administruar çdo ditë për 7 ditë);(iv) Grupi i trajtimit me inhibitor të grupit të kombinuar të kistit të G. duodenalis, grupi i trajtimit me frenues MCC950 (1.5×106 kiste/miu nëpërmjet kanalit, 10 mg/kg peshë trupore MCC950 në mënyrë intraperitoneale në ditë për 7 ditë në 3 orë).Pesha e trupit të çdo miu monitorohej çdo ditë dhe të gjithë minjtë u eutanizuan në ditën e 7-të.Duodenumi i mbledhur (3 cm i gjatë) u pre në copa të vogla në 1 ml PBS, cistat u shkatërruan brenda natës në PBS në 4°C dhe trofozoitët G. duodenalis.Duodenumi i freskët (1 cm i gjatë) u izolua për ngjyrosjen e hematoksilinës dhe eozinës (H&E).
Minjtë u ndanë në dy grupe: (i) grupi i kontrollit MOCK dhe (ii) grupi frenues MCC950.Kishte pesë trajtime në secilin grup (n = 7/grup trajtimi): (i) grupi i kontrollit negativ të trajtimit PBS (vetëm PBS; 100 μl/miu PBS, injeksion intramuskular (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) grupi i kontrollit negativ të plazmidit pcDNA3.1 (+) (100 μg/ADN miu, nëpërmjet injeksionit intramuskular (iii) grupi i kontrollit pozitiv të infeksionit të kistit G. duodenalis (1.5 x 106 kiste/miu, nëpërmjet kanalizimit) (iv) a); grupi i trajtuar me plazmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/ADN miu, me injeksion intramuskular) dhe (v) një grup i trajtuar me plazmid pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 μg/miu ADN-ja, pas 12 orësh kalimi, minjtë në grupin e frenuesit MCC950 morën një injeksion ditor intraperitoneal të MCC950 (10 mg/kg peshë trupore) për 7 ditë, ndërsa minjtë në grupin MOCK morën një vëllim të barabartë të trajtimit PBS. Mostrat e gjakut u u mblodhën nga minjtë e syrit dhe u lanë gjatë natës në 4 °C Mostrat e serumit u izoluan duke përdorur analizën imunosorbente të lidhur me enzimën (ELISA) dhe matjet e niveleve të IL-1β.
Tridhjetë e pesë minj u ndanë në pesë grupe (n=7/grup).Grupi 1 ishte një grup kontrolli negativ i trajtuar me PBS: minjtë morën 100 μl PBS në mënyrë intramuskulare dhe 3 ditë më vonë me grykë.Grupi 2 është një grup kontrolli pozitiv i infektuar me kiste G. duodenalis: minjve iu injektuan 100 μl PBS dhe 3 ditë më vonë 1.5 x 106 kiste/miu u injektuan në mënyrë intragastrike.Grupi i tretë - imunizimi plazmid me pcDNA3.1(+) në kombinim me një grup kontrolli për infeksionin e kistës duodenale: minjtë morën 100 μg ADN plazmide pcDNA3.1(+)(im) nga goja, 1.5×106 ciste/miu 3 për disa ditë.Grupet 4 dhe 5 ishin plazmidi rikombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine ose pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 plazmidi giardine në kombinim me infeksionin e kistit G. duodenalis.Grupi eksperimental: minjtë morën 100 µg pcDNA3.Plazmid ADN 1(+)-giardine (im), më pas 3 ditë më vonë, 1.5 × 106 kiste/miu u injektuan nëpërmjet kanalizimit.Pesha e trupit të çdo miu u monitorua pas futjes së kistit G. duodenalis përmes tubit.Duodenumi i freskët u mblodh për matjet e ngarkesës parazitare dhe analizën e ngjyrosjes HE.
Ndryshimet histopatologjike janë analizuar sipas një procedure të publikuar më parë [30].Duodeni i freskët u fiksua me fiksues të qelizave indore, i futur në parafinë, u pre në seksione 4 μm, u ngjyros me H&E dhe u analizua nën një mikroskop me dritë.Ndryshimet patologjike përfaqësuese në shtatë seksione të indeve nga shtatë minj të pavarur u vlerësuan nga një patolog që nuk ishte në dijeni të trajtimit dhe u kapën me zmadhim 200x.Gjatësia e vileve dhe thellësia e kriptave u mat në përputhje me metodat e përshkruara më parë.
Rezultatet in vitro dhe in vivo janë marrë në tre kopje.Grafikët u krijuan duke përdorur GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Dallimet midis dy grupeve u analizuan me T-test, ndërsa diferencat midis grupeve ≥3 u analizuan me analizën e variancës në një drejtim (ANOVA) duke përdorur softuerin SPSS (versioni 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Të dhënat u analizuan për homogjenitetin e variancës duke përdorur testin Levene të ndjekur nga testi post hoc i Bonferroni (B).Rëndësia shprehet si P<0.05, P<0.01 dhe P<0.001 (jo sinjifikative [ns]) (P>0.05).
Analiza jonë e mëparshme e proteomikës GEV në Enciklopedinë e Gjeneve dhe Gjenomave të Kiotos (KEGG) tregoi se shumë objektiva mund të përfshihen në aktivizimin e rrugëve të sinjalizimit inflamator [13].Ne zgjodhëm dy objektiva premtues, giardinat alfa-2 dhe alfa-7.3, i amplifikuam këto molekula dhe i përdorim ato për të ndërtuar vektorin e shprehjes eukariote pcDNA3.1(+).Pas renditjes, plazmidet rekombinante të shprehjes pcDNA3.1(+)-alfa-2 dhe alfa-7.3 giardine u transfektuan në makrofagët parësorë peritoneal të miut dhe u identifikua proteina e inflamacionit kaspase-1 p20 (një fragment i kaspazës-1 të aktivizuar). si molekula kryesore sqaruese që mund të shkaktojnë inflamacion.Rezultatet treguan se giardinat alfa-2 dhe alfa-7.3 mund të nxisin shprehjen e p20 kaspase-1 të ngjashme me GEV.Nuk u gjet asnjë efekt në aktivizimin e kaspazës-1 në kontrollin negativ të patrajtuar (vetëm PBS) dhe kontrollin plazmid pcDNA3.1 (+) (Figura 1).
Matja e aktivizimit të p20 kaspaz-1 nga pcDNA3.1(+)-alfa-2 dhe alfa-7.3 giardinat.Plazmidet rekombinante të shprehjes eukariote pcDNA3.1 (+)-alfa-2 dhe alfa-7.3 giardinat (mbi çdo korsi) u transfektuan në makrofagët peritoneal primar të miut dhe supernatantët e kulturës u grumbulluan 24 orë më vonë.Western blotting u përdor për të matur nivelet e shprehjes së proteinës inflamazome të nënshkrimit kaspase-1 p20.Grupi i trajtimit vetëm me PBS (rruga C) dhe grupi i monoterapisë pcDNA3.1 (+) (rruga pcDNA3.1) u përdorën si kontroll negativ dhe grupi i trajtimit GEV u përdor si kontroll pozitiv.Shprehja e proteinës rekombinante u konfirmua duke zbuluar një etiketë histidine në secilën proteinë, dhe brezat e pritshëm të proteinave ishin alfa-2 giardine (38.2 kDa) dhe alfa-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, vezikula jashtëqelizore Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vektor i linearizuar me EcoRV, SUP, supernatant
Për të përcaktuar nëse alfa-2 giardina dhe alfa-7.3 giardina nxisin shprehjen e p20 kaspase-1 dhe luajnë një rol në aktivizimin e përgjigjes inflamatore të NLRP3 të bujtësit, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine dhe pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin u transfektua në makrofagët parësorë peritoneal të miut me ADN plazmide rekombinante dhe u përcaktuan nivelet e shprehjes, lokalizimit dhe oligomerizimit të proteinave kryesore inflamatore NLRP3.Në këtë eksperiment, GEV u përdor si grupi i kontrollit pozitiv dhe grupi pa trajtim (vetëm PBS) ose grupi i trajtimit të transfeksionit pcDNA3.1 (+) ishte grupi negativ.Rezultatet treguan se, si në grupin GEV, ADN-ja plazmidike rekombinante e giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 dhe giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 rezultoi në rregullim të lartë të NLRP3, pro-IL-1β dhe aktivizimi i prokaspaz-1 dhe kaspaz-1 (Fig. 2a).Përveç kësaj, të dy giardinat induktuan sekretim të rëndësishëm të IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Figura 2b).Shumica e proteinave ASC ishin monomere në grupin pa trajtim ose në grupin e trajtimit të transfektuar me plazmidin pcDNA3.1(+), në kontrast me pcDNA3.1(+)-alfa-2 ose pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardinë.Oligomerizimi i ASC ndodhi në ADN-në plazmide rekombinante të grupit ose grupit të kontrollit pozitiv GEV, duke treguar një formë oligomerike (Figura 2c).Këto të dhëna paraprake sugjerojnë se alfa-2 giardina dhe alfa-7,3 giardina mund të nxisin aktivizimin e inflamacionit NLRP3.Studimet e mëvonshme imunofluoreshente të lokalizimit të ASC dhe NLRP3 treguan se në grupin e kontrollit negativ, proteina ASC u shpërnda në të gjithë citoplazmën dhe u shfaq si një sinjal pikësh pas stimulimit të pcDNA3.1(+)-alfa-2 me giardinë ose pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 grupi giardine ose grupi i kontrollit pozitiv GEV (Figura 2d).Në grupet pcDNA 3.1 të kontrollit negativ dhe të trajtuar me plazmidë, sinjali i proteinës NLRP3 nuk u zbulua, ndërsa një pikë sinjali fluoreshente në përgjigje të pcDNA3.1 (+)-alfa-2 giardine ose pcDNA3.1 (+)-alfa-7.3 u zbulua..giardina gjenden në citoplazmë ose pas stimulimit të HEV (Fig. 2e).Këto të dhëna tregojnë më tej se G. duodenalis giardin alfa-2 dhe giardin alfa-7.3 aktivizojnë inflamazomin NLRP3 në makrofagët peritoneal primar të miut.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin dhe pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin aktivizojnë inflamazomin NLRP3 në makrofagët peritoneal të miut.Transfektoni plazmidet rekombinante të shprehjes eukariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin dhe pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin në makrofagët dhe qelizat primare peritoneale të mirit, ose mblidhni supernatantin brenda 24 orëve për analizën e shprehjes, oligomerizimin , sekretim.dhe lokalizimi i proteinave kyçe inflamatore.Grupi i vetëm PBS (C) dhe grupi i vetëm i trajtimit pcDNA3.1 (+) u përdorën si kontroll negativ dhe grupi i trajtimit GEV u përdor si grup pozitiv.a Proteinat kryesore inflamatore NLRP3, duke përfshirë NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspase-1 dhe p20 kaspase-1, u zbuluan nga Western blotting.b Nivelet e sekretimit të IL-1β në supernatantët u përcaktuan duke përdorur analizën imunosorbente të lidhur me enzimën (ELISA).Dallimet ndërmjet grupeve të kontrollit dhe atyre eksperimentale u analizuan me anë të analizës së variancës në një drejtim (ANOVA) duke përdorur softuerin SPSS versioni 22.0.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme midis grupeve **P<0.01 dhe ***P<0.001.c Nivelet e oligomerizimit të ASC në pelet u përcaktuan nga analiza e ndërlidhjes DSS, ndërsa nivelet e ASC në lizat e qelizave u përdorën si një kontroll ngarkimi.d Vizualizimi i lokalizimit të ISC duke përdorur imunofluoreshencë.Është përdorur imunofluoreshenca për të vizualizuar lokalizimin e NLRP3.ASC, proteina apoptotike e ngjashme me njolla;IL, interleukin;NLRP3, receptor 3 i ngjashëm me oligomerizimin që lidh nukleotidin;ns, jo domethënëse (P > 0.05)
Si G. duodenalis ashtu edhe GEV-të që ai sekreton aktivizojnë inflamazomin NLRP3 dhe rregullojnë përgjigjet inflamatore të bujtësit in vitro.Kështu, roli i inflamazomit NLRP3 në patogjenitetin e G. duodenalis mbetet i paqartë.Për të hetuar këtë çështje, ne projektuam një eksperiment midis minjve të infektuar me kist G. duodenalis dhe minjve të infektuar me kist G. duodenalis + trajtim me frenues MCC950 dhe krahasuam shprehjen inflamazome NLRP3 kur infektoheshin me kist G. duodenalis.Një skemë e detajuar e eksperimentit është paraqitur në Fig. 3a.Ndryshimet në peshën trupore të minjve në grupe të ndryshme trajtimi u monitoruan për 7 ditë pas infektimit me kiste, dhe rezultatet tregohen në Fig. 3b.Krahasuar me grupin e trajtuar me PBS të pastër, rezultatet treguan se (i) pesha trupore e minjve të infektuar me kist G. duodenalis u ul nga dita 3 në ditën e 7 pas infektimit;(ii) trajtimi me frenuesin MCC950 nuk pati efekt të rëndësishëm në peshën trupore të minjve..Krahasuar me grupin e infeksionit të vetëm, BW e grupit të infeksionit duodenal të trajtuar me MCC950 u ul në shkallë të ndryshme (Dita 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dita 2: ANOVA, F( 3, 24 ) = 0.4602, P<0.0001: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052 F (3, 24)=0.6497, P=0.0645: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202;Këto të dhëna tregojnë se inflamazoma NLRP3 mbron minjtë nga humbja e konsiderueshme e peshës në fazat e hershme (2-4 ditë) të infeksionit duodenal.Më pas synuam të zbulonim trofozoitët G. duodenalis në lëngun e lavazhit duodenal dhe rezultatet janë paraqitur në figurën 3c.Krahasuar me grupin e infeksionit me kist G. duodenalis, numri i trofozoiteve në duoden u rrit ndjeshëm pas bllokimit të inflamazomes NLRP3 (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Indet duodenale të ngjyrosura me HE treguan, krahasuar me kontrollin negativ të trajtuar vetëm me PBS dhe MCC950: (i) infeksioni i kistit të G. duodenalis rezultoi në dëmtim të vileve duodenale (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) dhe atrofia e kriptës (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duoden nga minjtë e infektuar me kiste G. duodenalis dhe të trajtuar me frenues MCC950.Vilet duodenale ishin të dëmtuara dhe të vdekura (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) me atrofi dhe degëzim të kriptës (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Këto rezultate sugjerojnë se inflamazoma NLRP3 luan një rol në reduktimin e patogjenitetit të G. duodenalis.
Roli i inflamazomit NLRP3 në infeksionin Giardia duodenum.Minjtë u morën me gaz (iv) me kiste duodenokokale dhe më pas u trajtuan me ose pa MCC950 (ip).Grupet e trajtimit të vetëm me PBS ose MCC950 u përdorën si kontrolle.Grupi eksperimental dhe regjimi i trajtimit.b Pesha trupore e minjve në secilin prej grupeve të ndryshme të trajtimit u monitorua për 7 ditë.Dallimi midis grupit të infeksionit G. duodenalis dhe grupit të trajtimit të infeksionit G. duodenalis + MCC950 u analizua me T-test duke përdorur versionin 22.0 të softuerit SPSS.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme në *P<0.05, **P<0.01 ose ***P<0.001.c Ngarkesa parazitare u përcaktua duke numëruar numrin e trofozoitëve në lëngun e lavazhit duodenal.Dallimi midis grupit të infeksionit G. duodenalis dhe grupit të trajtimit të infeksionit G. duodenalis + MCC950 u analizua me T-test duke përdorur versionin 22.0 të softuerit SPSS.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme në *P <0.05.d Rezultatet e ngjyrosjes së hematoksilinës dhe eozinës (H&E) të histopatologjisë duodenale.Shigjetat e kuqe tregojnë dëmtimin e vileve, shigjetat jeshile tregojnë dëmtimin e kriptave.Shiriti i shkallës: 100 µm.e, f Analiza statistikore e lartësisë së vileve duodenale dhe lartësisë së kriptës së miut.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme në *P<0.05 dhe **P<0.01.Rezultatet janë marrë nga 7 eksperimente të pavarura biologjike.BW, pesha trupore;ig, rruga e lindjes intragastrike;ip, rruga e shpërndarjes intraperitoneale;ns, jo domethënëse (P > 0.05);PBS, kripë e kripur e puferuar me fosfat;WT, tip i egër
Sekretimi i IL-1β është një shenjë dalluese e aktivizimit të inflamacionit.Për të përcaktuar nëse G. duodenalis alfa-2 giardina dhe alfa-7.3 giardina aktivizojnë in vivo in vivo inflamazomin e strehuesit NLRP3, ne përdorëm minj WT të patrajtuar (grup sham) dhe minj të bllokuar nga inflamazomi NLRP3 (grupi i trajtimit të frenuar nga MCC950).Një skemë e detajuar e eksperimentit është paraqitur në Fig. 4a.Grupet eksperimentale përbëheshin nga minj të trajtuar me PBS, trajtimi i kistit G. duodenalis me grykë, injeksion intramuskular i pcDNA3.1 dhe injeksion intramuskular i pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine ose pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine.Në ditën e 7-të pas administrimit intramuskular të plazmidit rekombinant, u mblodh serumi dhe u përcaktua niveli i IL-1β në secilin grup.Siç tregohet në figurën 4b, në grupin MOCK: (i) krahasuar me grupin PBS, trajtimi me pcDNA3.1 nuk kishte efekt të rëndësishëm në sekretimin e IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), megjithatë, Sekretimi i IL-β u ngrit ndjeshëm në grupin e kistës G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardine dhe pcDNA3.1- Injeksioni intramuskular i alfa-7.3 giardine rriti ndjeshëm nivelet e IL-1β në serum (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina induktoi nivele të larta të sekretimit të IL-1β në grupin e injektimit intramuskular pcDNA3.1-alfa-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Krahasuar me secilin grup në grupin e trajtimit MCC950 dhe grupin MOCK: (i) nivelet e sekretimit të IL-1β në grupin e kontrollit PBS dhe grupin e kontrollit pcDNA3.1 u ulën në një masë të caktuar pas bllokimit të frenuesit MCC950, por ndryshimi nuk ishte domethënëse (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) pas bllokimit të MCC950., sekretimi i IL-1β u reduktua ndjeshëm në grupin e infektuar me kist G. duodenalis, grupin pcDNA3.1-alfa-2 giardine dhe grupin pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3, F(; ) = 3,540, P = 0,0164).Këto rezultate sugjerojnë që alfa-2 giardina dhe alfa-7.3 giardina ndërmjetësojnë aktivizimin e in vivo të inflamazomës NLRP3.
pcDNA3.1(+)-giardinat aktivizojnë in vivo in vivo-në e bujtësit NLRP3.Minjtë u imunizuan (IM) me plazmidin rekombinant të shprehjes eukariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinë ose pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinë dhe më pas u trajtuan me MCC950 (ip; grupi MCC950) ose jo (grup i rremë ).Grupi i trajtimit me plazmid PBS ose pcDNA3.1(+) u përdor si kontroll negativ, grupi i trajtimit me kist G. duodenalis u përdor si kontroll pozitiv.Grupi eksperimental dhe regjimi i trajtimit.b Nivelet serike të IL-1β në minj u matën në ditën e 7 me analizën ELISA.Dallimet midis grupeve në grupin MOCK u analizuan duke përdorur ANOVA njëkahëshe dhe dallimet midis grupit MOCK dhe grupit MCC950 u analizuan duke përdorur testin t të softuerit SPSS versioni 22.0.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme midis grupeve të trajtimit në grupin MOCK, *P<0.05 dhe ***P<0.001;Shenjat e dollarit ($) tregojnë dallime të rëndësishme midis secilit grup në grupin MOCK dhe grupit MCC950 në P<0.05.Rezultatet e shtatë eksperimenteve të pavarura biologjike.i, injeksion intramuskular, ns, jo i rëndësishëm (P > 0.05)
Për të hetuar efektin e aktivizimit të ndërmjetësuar nga giardina alfa-2 dhe alfa-7.3 të inflamazomes së bujtësit NLRP3 në infektivitetin e G. duodenalis, ne përdorëm minj WT C57BL/6 dhe injektuam alfa-2 giardinë dhe alfa-7.3 giardinë.plazmidi u injektua në mënyrë intramuskulare, pas 3 ditësh përmes tubit gastrik të kistit G. duodenalis, pas së cilës minjtë u vëzhguan për 7 ditë.Një skemë e detajuar e eksperimentit është paraqitur në Fig. 5a.Pesha trupore e çdo miu matej çdo ditë, mostrat e indit të freskët duodenal u mblodhën në ditën e 7 pas administrimit përmes një tubi gastrik, u mat numri i trofozoitëve dhe u vëzhguan ndryshime histopatologjike.Siç tregohet në figurën 5b, me rritjen e kohës së të ushqyerit, BW e minjve në secilin grup u rrit gradualisht.MT e minjve filloi të zvogëlohej në ditën e 3-të pas administrimit intragastrik të cisteve G. duodenalis, dhe më pas u rrit gradualisht.Aktivizimi i inflamazomës NLRP3 i shkaktuar nga injeksioni intramuskular i alfa-2 giardine dhe alfa7.3 giardine zbuti ndjeshëm humbjen e peshës tek minjtë (Dita 1: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Dita 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dita 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409: pcDNA3,1-alfa-2, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dita 3: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083: pcDNA3,1-alfa-ANOVA; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dita 4: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dita 5: pcDNA3,1-alfa - 2 giardinë, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dita 5: pcDNA3,1-alfa -7,3 giardinë, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dita 6: 1 -DNA3. alfa-2 giardinë, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dita 6: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardinë, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dita 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardinë, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Dita 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinë, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Ngarkesa parazitare u vlerësua në duoden (Fig. 5c).Krahasuar me kontrollin pozitiv të patrajtuar dhe grupin e injektuar me vektorin bosh pcDNA3.1, numri i trofozoitëve G. duodenalis u reduktua ndjeshëm në grupet e injektuara me α-2 giardinë dhe α-7,3 giardinë (pcDNA3.1-alfa -2 giardinë: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinë: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Për më tepër, giardina alfa-7.3 ishte më mbrojtëse te minjtë sesa giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Rezultatet e ngjyrosjes HE janë paraqitur në fig.5d–f.Minjtë e injektuar me alfa-2 giardinë dhe alfa-7.3 giardinë kishin më pak lezione të indit duodenal, të manifestuara nga dëmtimi i vileve, krahasuar me minjtë e injektuar me G. duodenalis dhe minjtë e injektuar me G. duodenalis në kombinim me një vektor të zbrazët pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 ose P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 ose P = 0.0055) dhe atrofi e reduktuar e kriptës (pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 ose P = 0.0158; pcDNA3.1-alfa-AVA-7. , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ose P = 0,0191).Këto rezultate sugjerojnë që alfa-2 giardina dhe alfa-7,3 giardina reduktojnë infektivitetin e G. duodenalis duke aktivizuar in vivo inflamazomin NLRP3.
Roli i pcDNA3.1(+)-giardinave në infeksionin G. duodenalis.Minjtë u imunizuan (IM) me plazmide rekombinante të shprehjes eukariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinë ose pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinë dhe më pas u sfiduan me kista G. duodenalis (ig).Grupi PBS dhe grupi i trajtimit të kistit pcDNA3.1(+) + duodenale u përdorën si grupe kontrolli negativ dhe grupi i trajtimit të kistit duodenal u përdor si grup kontrolli pozitiv.Grupi eksperimental dhe regjimi i trajtimit.b MT e minjve në secilin prej grupeve të ndryshme të trajtimit u monitorua për 7 ditë pas sfidës.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme midis grupeve në grupin G. duodenalis dhe grupit pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine, *P <0.05, **P <0.01 dhe ***P <0.001;shenja e dollarit ($) tregon një ndryshim domethënës midis secilit grup të G. duodenalis dhe grupit pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine, $$P<0.01 dhe $$$P<0.001.c Ngarkesa parazitare u përcaktua duke numëruar numrin e trofozoitëve në 1 ml lavazh duodenal nga duodeni (3 cm i gjatë) dhe u shpreh si numri i parazitëve për cm duoden.Dallimet midis grupit të infeksionit G. duodenalis, grupit pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine dhe grupit pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine u analizuan me ANOVA njëkahëshe duke përdorur versionin 22.0 të softuerit SPSS.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme në **P<0.01 dhe ***P<0.001.d Ndryshimet histopatologjike në duoden.Shigjetat e kuqe tregojnë dëmtimin e vileve, shigjetat jeshile tregojnë dëmtimin e kriptave.Shiriti i shkallës: 100 µm.e, f Analiza statistikore e lartësisë së vileve duodenale të miut (e) dhe lartësisë së kriptës (f).Dallimet midis grupeve në Figurën 1d u analizuan me ANOVA të njëanshme duke përdorur versionin 22.0 të softuerit SPSS.Yjet tregojnë dallime të rëndësishme në *P<0.05 dhe **P<0.01.Rezultatet e shtatë eksperimenteve të pavarura biologjike.ns, jo domethënëse (P > 0.05)
Giardia duodenum është një parazit i njohur intestinal i njerëzve dhe gjitarëve të tjerë që shkakton giardiasis.Në vitin 2004, ajo u përfshi në Iniciativën për Sëmundjet e Neglizhuara të OBSH-së për shkak të prevalencës së saj të lartë gjatë 6 viteve, veçanërisht në komunitetet me status të ulët socio-ekonomik [32].Sistemi imunitar i lindur luan një rol kritik në përgjigjen imune ndaj infeksionit G. duodenalis.Është raportuar se makrofagët e miut gllabërojnë dhe vrasin G. duodenalis duke lëshuar kurthe jashtëqelizore [33].Studimet tona të mëparshme kanë treguar se G. duodenalis, një parazit jashtëqelizor jo-invaziv, aktivizon rrugët sinjalizuese inflamatore p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 dhe NLRP3 në makrofagët e miut për të rregulluar përgjigjet inflamatore të bujtësit dhe GEV i çliruar mund të përmirësojë këtë proces.13], 24].Sidoqoftë, PAMP-të e sakta të përfshira në inflamacionin e rregulluar nga inflamazomi NLRP3 në GEV dhe roli i inflamazomit NLRP3 në giardiasis mbeten për t'u sqaruar.Për të hedhur dritë mbi këto dy pyetje, ne kryem këtë studim.
Inflamazoma NLRP3 ndodhet në citoplazmën e qelizave imune dhe mund të aktivizohet nga grimca të ndryshme si kristalet e acidit urik, toksinat, bakteret, viruset dhe parazitët.Në studimet bakteriale, toksinat janë identifikuar si PAMP kyç që aktivizojnë sensorët inflamatorë, duke çuar në inflamacion dhe vdekje të qelizave [34].Disa toksina të ndryshme strukturore, të tilla si hemolizina nga Staphylococcus aureus [35] dhe Escherichia coli [36], hemolizina BL (HBL) nga enterotoksina (NHE) [37], nxisin aktivizimin e inflamacionit NLRP3.Studimet virale kanë treguar se proteinat e virulencës si proteina e mbështjelljes (E) SARS-COV-2 [38] dhe proteina NS5 e virusit Zika [39] janë PAMP të rëndësishme të njohura nga receptori NLRP3.Në studimet e parazitëve, shumë parazitë janë raportuar të jenë të lidhur me aktivizimin inflamator të bujtësit, si Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] dhe Leishmania [42].Proteinat e dendura të granulave GRA35, GRA42 dhe GRA43, të shoqëruara me virulencën e Toxoplasma gondii, kërkohen për induktimin e piroptozës në makrofagët e minjve Lewis [43].Përveç kësaj, disa studime të Leishmania janë fokusuar në molekula individuale të përfshira në inflamazomin NLRP3, të tilla si lipofosfoglikani i membranës së parazitit [44] ose metalloproteaza e zinkut [45].Midis familjes së gjeneve alfa-giardin të ngjashme me aneksinë, alfa-1 giardin është treguar të jetë një kandidat potencial për vaksinë që ofron mbrojtje kundër G. duodenalis në një model miu [18].Në studimin tonë, ne zgjodhëm faktorët e virulencës G. duodenalis alfa-2 dhe alfa-7,3 giardine, të cilët janë unikë për giardia, por relativisht më pak të raportuara.Këto dy gjene objektiv u klonuan në vektorin e sistemit të shprehjes eukariote pcDNA3.1 (+) për analizën e aktivizimit të inflamacionit.
Në modelin tonë të miut, fragmentet e kaspazave të copëtuara shërbejnë si shënues të aktivizimit inflamator.Pas stimulimit, NLRP3 ndërvepron me ASC, rekruton prokaspaza dhe gjeneron kapaza aktive që çajnë pro-IL-1β dhe pro-IL-18 në IL-1β dhe IL-18 të pjekur, përkatësisht -18.Kaspazat inflamatore (kaspazat-1, -4, -5 dhe -11) janë një familje e konservuar e proteazave të cisteinës që janë kritike për mbrojtjen e lindur dhe janë të përfshira në inflamacionin dhe vdekjen e programuar të qelizave [46].Kapasa-1 aktivizohet nga inflamazomet kanonike [47], ndërsa kaspazat-4, -5 dhe -11 çahen gjatë formimit të inflamazomeve atipike [48].Në këtë studim, ne përdorëm makrofagët peritoneal të miut si model dhe hetuam kaspazën-1 të copëtuar p20 kaspase-1 si një shënues i aktivizimit të inflamacionit të NLRP3 të bujtësit në studimet e infeksionit G. duodenalis.Rezultatet treguan se shumë alfa-giardina janë përgjegjëse për aktivizimin tipik të inflamacionit, i cili është në përputhje me zbulimin e molekulave kyçe të virulencës të përfshira në baktere dhe viruse.Megjithatë, studimi ynë është vetëm një ekran paraprak dhe ka molekula të tjera që mund të aktivizojnë inflamazomet jo-klasike, pasi studimi ynë i mëparshëm gjeti inflamazome klasike dhe jo klasike në infeksionin G. duodenalis [13].Për të përcaktuar më tej nëse kaspaza-1 e gjeneruar p20 është e lidhur me inflamazomin NLRP3, ne transfektuam giardinat alfa-2 dhe alfa-7.3 në makrofagët peritoneal të miut për të përcaktuar nivelet kryesore të shprehjes së proteinës së molekulës dhe nivelet e oligomerizimit të ASC, duke konfirmuar që të dy α-giardinat aktivizohen inflamatore NLRP3.Rezultatet tona janë paksa të ndryshme nga ato të Manko-Prykhoda et al., të cilët raportuan se stimulimi i qelizave Caco-2 vetëm me shtame EPEC G. muris ose E. coli mund të rrisë intensitetin e fluoreshencës së NLRP3, ASC dhe kaspaz-1. edhe pse jo në mënyrë të konsiderueshme, ndërsa si kostimulimi i G. muris dhe E. coli rriti nivelet e tre proteinave [49].Kjo mospërputhje mund të jetë për shkak të dallimeve në përzgjedhjen e specieve Giardia, linjave qelizore dhe qelizave primare.Ne kryem gjithashtu analiza in vivo duke përdorur MCC950 në minj femra 5-javëshe WT C57BL/6, të cilët janë më të ndjeshëm ndaj G. duodenalis.MCC950 është një frenues i fuqishëm dhe selektiv i molekulës së vogël NLRP3 që bllokon aktivizimin kanonik dhe jo-kanonik të NLRP3 në përqendrime nanomolare.MCC950 pengon aktivizimin e NLRP3, por nuk ndikon në aktivizimin e rrugëve inflamatore AIM2, NLRC4 dhe NLRP1 ose rrugëve të sinjalizimit TLR [27].MCC950 bllokon aktivizimin e NLRP3, por nuk pengon fillimin e NLRP3, rrjedhjen e K+, fluksin e Ca2+ ose ndërveprimin midis NLRP3 dhe ASC;në vend të kësaj, ai pengon aktivizimin inflamator të NLRP3 duke bllokuar oligomerizimin e ASC [27].Prandaj, ne përdorëm MCC950 në një studim in vivo për të përcaktuar rolin e inflamazomit NLRP3 pas injektimit të giardinës.Kaspaz-1 p10 i aktivizuar copëton citokinat pro-inflamatore pro-IL-1β dhe pro-IL-18 në IL-1β dhe IL-18 të pjekur [50].Në këtë studim, nivelet e serumit të IL-1β në minjtë e trajtuar me giardinë me ose pa MCC950 u përdorën si një tregues nëse inflamazoma NLRP3 ishte aktivizuar.Siç pritej, trajtimi MCC950 uli ndjeshëm nivelet e IL-1β në serum.Këto të dhëna tregojnë qartë se G. duodenalis giardin alfa-2 dhe giardin alfa-7.3 janë në gjendje të aktivizojnë inflamazomin e miut NLRP3.
Të dhënat e rëndësishme të grumbulluara gjatë dekadës së fundit kanë treguar se IL-17A është rregullatori kryesor i imunitetit kundër G. muris, duke nxitur sinjalizimin e IL-17RA, duke prodhuar peptide antimikrobiale dhe duke rregulluar aktivizimin e komplementit [51].Megjithatë, infeksioni Giardia ndodh më shpesh tek të rriturit e rinj dhe është raportuar se infeksioni Giardia tek minjtë e rinj nuk aktivizon përgjigjen IL-17A për të ushtruar efektin e tij mbrojtës [52], duke i shtyrë studiuesit të kërkojnë Giardia të tjera imunomoduluese.mekanizmat e infeksionit me helminth.Autorët e një studimi të fundit raportuan se G. muris mund të aktivizojë inflamazomin NLRP3 nga E. coli EPEC, i cili promovon prodhimin e peptideve antimikrobiale dhe zvogëlon aftësinë e tij ngjitëse dhe numrin e trofozoitëve në traktin intestinal, duke reduktuar kështu ashpërsinë e zorrës së trashë. sëmundjet e shkaktuara nga bacilet [49].Inflamazoma NLRP3 është e përfshirë në zhvillimin e sëmundjeve të ndryshme.Studimet kanë treguar se Pseudomonas aeruginosa shkakton autofagjinë në makrofagë për të shmangur vdekjen e qelizave dhe ky proces varet nga aktivizimi i inflamazomës NLRP3 [53].Për N. caninum, aktivizimi i ndërmjetësuar nga speciet reaktive të oksigjenit të inflamazomës NLRP3 kufizon replikimin e tij në bujtës, duke e bërë atë një objektiv të mundshëm terapeutik [9].Paracoccidioides brasiliensis është gjetur të nxisë aktivizimin e inflamazomës NLRP3 në qelizat dendritike me prejardhje nga palca e eshtrave të miut, duke rezultuar në lirimin e citokinës inflamatore IL-1β, e cila luan një rol kritik në mbrojtjen e bujtësit [10].Disa lloje Leishmania, duke përfshirë L. amazonensis, L. major, L. braziliensis dhe L. infantum chagasi, aktivizojnë NLRP3 dhe kaspaz-1 të varur nga ASC në makrofagë, si dhe infeksionin me Leishmania.Replikimi i parazitëve është rritur te minjtë me mungesë të gjenit NLRP3/ASC/kaspase-1 [11].Zamboni etj.Infeksioni me leishmania është raportuar se shkakton aktivizimin e inflamazomës NLRP3 në makrofagë, gjë që kufizon replikimin e parazitëve ndërqelizor.Kështu, Leishmania mund të pengojë aktivizimin e NLRP3 si një strategji shmangieje.Në studimet in vivo, inflamazomi NLRP3 kontribuoi në eliminimin e Leishmania, por nuk preku indet [54].Anasjelltas, në studimet e helminthiazës, aktivizimi i inflamazomës NLRP3 shtypi imunitetin mbrojtës të strehuesit kundër helminthiazës gastrointestinale [12].Shigella është një nga bakteret kryesore që shkakton diarre në mbarë botën.Këto baktere mund të nxisin prodhimin e IL-1β përmes rrjedhjes K+ të ndërmjetësuar nga receptori P2X7, specieve reaktive të oksigjenit, acidifikimit lizozomal dhe dëmtimit mitokondrial.Inflamazoma NLRP3 rregullon negativisht fagocitozën dhe aktivitetin baktericid të makrofagëve kundër Shigellës [55].Studimet e plazmodiumit kanë treguar se minjtë me mungesë AIM2, NLRP3 ose kaspase-1 të infektuar me Plasmodium prodhojnë nivele të larta të interferonit të tipit 1 dhe janë më rezistent ndaj infeksionit me Plasmodium [56].Megjithatë, roli i alfa-2 giardine dhe alfa-7.3 giardine në nxitjen e aktivizimit patogjen të inflamacionit NLRP3 në minj është i paqartë.
Në këtë studim, frenimi i inflamazomes NLRP3 nga MCC950 uli BW dhe rriti numrin e trofozoiteve në lëngun e lavazhit të zorrëve tek minjtë, duke rezultuar në ndryshime më të rënda patologjike në indin duodenal.Giardina alfa-2 dhe giardina alfa-7.3 aktivizojnë inflamazomin NLRP3 të miut pritës, rrisin peshën trupore të miut, zvogëlojnë numrin e trofozoiteve në lëngun e lavazhit të zorrëve dhe lehtësojnë lezionet patologjike duodenale.Këto rezultate sugjerojnë se G. duodenalis mund të aktivizojë inflamazomin e bujtësit NLRP3 nëpërmjet alfa-2 giardine dhe alfa-7,3 giardine, duke reduktuar patogjenitetin e G. duodenalis në minj.
Së bashku, rezultatet tona tregojnë se giardinat alfa-2 dhe alfa-7.3 nxisin aktivizimin e inflamazomës së bujtësit NLRP3 dhe reduktojnë infektivitetin e G. duodenalis te minjtë.Prandaj, këto molekula janë objektiva premtuese për parandalimin e giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: një përmbledhje.Kohët e fundit u zbulua se Pat Inflamm është alergjik ndaj ilaçeve.2019; 13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: një përmbledhje e farmakoterapisë.Mendimi i ekspertit të një farmacisti.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, rezistenca ndaj ilaçeve dhe zbulimi i objektivave të rinj.Infekton objektivat e drogës Disord.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etj. Sëmundjet inflamatore dhe inflamatore NLRP3.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Roli i inflamazomeve në inflamacionin dhe kancerin e zorrëve.Gastroenterologjia.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Aktivizimi kanonik dhe atipik inflamazome NLRP3 në udhëkryqin e tolerancës imune dhe inflamacionit të zorrëve.para-imune.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, etj.Aktivizimi inflamazom NLRP3 i ndërmjetësuar nga ROS përfshihet në përgjigje të infeksionit N. caninum.Vektor paraziti.2020; 13:449.