Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Vektorët e gjeneve për trajtimin e fibrozës cistike pulmonare duhet të synohen në rrugët e frymëmarrjes përçuese, pasi transduksioni periferik i mushkërive nuk ka efekt terapeutik.Efikasiteti i transduksionit viral lidhet drejtpërdrejt me kohën e qëndrimit të bartësit.Megjithatë, lëngjet e shpërndarjes si bartësit e gjeneve shpërndahen natyrshëm në alveola gjatë thithjes dhe grimcat terapeutike të çdo forme hiqen me shpejtësi nga transporti mukociliar.Zgjatja e kohës së qëndrimit të bartësve të gjeneve në traktin respirator është e rëndësishme, por e vështirë për t'u arritur.Grimcat magnetike të konjuguara me bartës që mund të drejtohen në sipërfaqen e traktit respirator mund të përmirësojnë shënjestrimin rajonal.Për shkak të problemeve me imazhet in vivo, sjellja e grimcave të tilla të vogla magnetike në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes në prani të një fushe magnetike të aplikuar është kuptuar keq.Qëllimi i këtij studimi ishte përdorimi i imazhit sinkrotron për të vizualizuar in vivo lëvizjen e një sërë grimcash magnetike në trakenë e minjve të anestezuar në mënyrë që të studionte dinamikën dhe modelet e sjelljes së grimcave të vetme dhe të mëdha in vivo.Më pas vlerësuam nëse shpërndarja e grimcave magnetike lentivirale në prani të një fushe magnetike do të rriste efikasitetin e transduksionit në trakenë e miut.Imazhi me rreze X sinkrotron tregon sjelljen e grimcave magnetike në fusha magnetike stacionare dhe lëvizëse in vitro dhe in vivo.Grimcat nuk mund të tërhiqen lehtësisht nëpër sipërfaqen e rrugëve ajrore të gjalla duke përdorur magnet, por gjatë transportit, depozitat përqendrohen në fushën e shikimit, ku fusha magnetike është më e fortë.Efikasiteti i transduksionit u rrit gjithashtu gjashtëfish kur grimcat magnetike lentivirale u shpërndanë në prani të një fushe magnetike.Të marra së bashku, këto rezultate sugjerojnë se grimcat magnetike lentivirale dhe fushat magnetike mund të jenë qasje të vlefshme për të përmirësuar shënjestrimin e vektorit të gjeneve dhe nivelet e transduksionit në rrugët ajrore përçuese in vivo.
Fibroza cistike (CF) shkaktohet nga variacionet në një gjen të vetëm të quajtur rregullatori i përcjellshmërisë transmembranore CF (CFTR).Proteina CFTR është një kanal jonik që është i pranishëm në shumë qeliza epiteliale në të gjithë trupin, duke përfshirë rrugët e frymëmarrjes, një vend kryesor në patogjenezën e fibrozës cistike.Defektet në CFTR çojnë në transport jonormal të ujit, dehidrim të sipërfaqes së rrugëve të frymëmarrjes dhe ulje të thellësisë së shtresës së lëngut sipërfaqësor të rrugëve të frymëmarrjes (ASL).Ai gjithashtu dëmton aftësinë e sistemit të transportit mukociliar (MCT) për të pastruar rrugët e frymëmarrjes nga grimcat e thithura dhe patogjenët.Qëllimi ynë është të zhvillojmë një terapi gjenetike lentivirale (LV) për të dhënë kopjen e saktë të gjenit CFTR dhe për të përmirësuar ASL, MCT dhe shëndetin e mushkërive, dhe për të vazhduar zhvillimin e teknologjive të reja që mund të matin këto parametra in vivo1.
Vektorët LV janë një nga kandidatët kryesorë për terapinë gjenetike të fibrozës cistike, kryesisht sepse ata mund të integrojnë përgjithmonë gjenin terapeutik në qelizat bazale të rrugëve të frymëmarrjes (qelizat burimore të rrugëve ajrore).Kjo është e rëndësishme sepse ato mund të rivendosin hidratimin normal dhe pastrimin e mukusit duke u diferencuar në qeliza funksionale sipërfaqësore të rrugëve ajrore të korrigjuara nga gjenet të shoqëruara me fibrozë cistike, duke rezultuar në përfitime gjatë gjithë jetës.Vektorët LV duhet të drejtohen kundër rrugëve të frymëmarrjes përçuese, pasi këtu fillon përfshirja e mushkërive në CF.Dorëzimi i vektorit më thellë në mushkëri mund të rezultojë në transduksion alveolar, por kjo nuk ka asnjë efekt terapeutik në fibrozën cistike.Megjithatë, lëngjet si bartësit e gjeneve migrojnë natyrshëm në alveola kur thithen pas lindjes së fëmijës3,4 dhe grimcat terapeutike dëbohen me shpejtësi në zgavrën e gojës nga MCTs.Efikasiteti i transduksionit LV lidhet drejtpërdrejt me kohëzgjatjen e kohës që vektori qëndron pranë qelizave të synuara për të lejuar marrjen qelizore - "koha e qëndrimit" 5 e cila shkurtohet lehtësisht nga fluksi tipik rajonal i ajrit si dhe nga thithja e koordinuar e mukusit dhe grimcave MCT.Për fibrozën cistike, aftësia për të zgjatur kohën e qëndrimit të LV në rrugët e frymëmarrjes është e rëndësishme për të arritur nivele të larta transduksioni në këtë zonë, por deri më tani ka qenë sfiduese.
Për të kapërcyer këtë pengesë, ne propozojmë që grimcat magnetike LV (MPs) mund të ndihmojnë në dy mënyra plotësuese.Së pari, ato mund të udhëhiqen nga një magnet në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes për të përmirësuar shënjestrimin dhe për të ndihmuar grimcat bartëse të gjeneve të jenë në zonën e duhur të rrugës ajrore;dhe ASL) lëvizin në shtresën qelizore 6. MP-të përdoren gjerësisht si mjete të shënjestruar të shpërndarjes së barnave kur lidhen me antitrupat, ilaçet e kimioterapisë ose molekula të tjera të vogla që lidhen me membranat qelizore ose lidhen me receptorët e tyre përkatës të sipërfaqes qelizore dhe grumbullohen në vendet e tumorit në prania e elektricitetit statik.Fushat magnetike për terapinë e kancerit 7. Metoda të tjera “hipertermike” synojnë të vrasin qelizat e tumorit duke ngrohur MP kur ekspozohen ndaj fushave magnetike lëkundëse.Parimi i transfeksionit magnetik, në të cilin një fushë magnetike përdoret si një agjent transfeksioni për të rritur transferimin e ADN-së në qeliza, përdoret zakonisht in vitro duke përdorur një sërë vektorësh gjenesh jovirale dhe virale për linjat qelizore të vështira për t'u transduktuar. ..Efikasiteti i magnetotransfeksionit LV me shpërndarjen e LV MP in vitro në një linjë qelizore të epitelit bronkial të njeriut në prani të një fushe magnetike statike u vendos, duke rritur efikasitetin e transduksionit me 186 herë krahasuar vetëm me vektorin LV.LV MT është aplikuar gjithashtu në një model in vitro të fibrozës cistike, ku transfektimi magnetik rriti transduksionin e LV në kulturat e ndërfaqes ajër-lëng me një faktor prej 20 në prani të pështymës së fibrozës cistike10.Megjithatë, magnetotransfeksioni i organeve in vivo ka marrë relativisht pak vëmendje dhe është vlerësuar vetëm në disa studime të kafshëve11,12,13,14,15, veçanërisht në mushkëri16,17.Megjithatë, mundësitë e transfeksionit magnetik në terapinë e mushkërive në fibrozën cistike janë të qarta.Tan et al.(2020) deklaroi se "një studim vërtetimi mbi shpërndarjen efektive pulmonare të nanogrimcave magnetike do të hapë rrugën për strategjitë e ardhshme të inhalimit CFTR për të përmirësuar rezultatet klinike në pacientët me fibrozë cistike"6.
Sjellja e grimcave të vogla magnetike në sipërfaqen e traktit respirator në prani të një fushe magnetike të aplikuar është e vështirë për t'u vizualizuar dhe studiuar, dhe për këtë arsye ato kuptohen dobët.Në studime të tjera, ne kemi zhvilluar një metodë të imazhit me rreze X me kontrast në fazën e përhapjes së sinkrotronit (PB-PCXI) për imazhe jo-invazive dhe përcaktimin sasior të ndryshimeve të vogla in vivo në thellësinë ASL18 dhe sjelljen MCT19,20 për të matur drejtpërdrejt hidratimi i sipërfaqes së kanalit të gazit. dhe përdoret si tregues i hershëm i efektivitetit të trajtimit.Përveç kësaj, metoda jonë e vlerësimit MCT përdor grimca me diametër 10–35 µm të përbëra nga alumini ose xhami me indeks të lartë thyes si shënues MCT të dukshëm me PB-PCXI21.Të dyja metodat janë të përshtatshme për imazhin e një sërë llojesh grimcash, duke përfshirë MP.
Për shkak të rezolucionit të lartë hapësinor dhe kohor, analizat tona ASL dhe MCT të bazuara në PB-PCXI janë të përshtatshme për të studiuar dinamikën dhe modelet e sjelljes së grimcave të vetme dhe të mëdha in vivo për të na ndihmuar të kuptojmë dhe optimizojmë metodat e shpërndarjes së gjenit MP.Qasja që ne përdorim këtu bazohet në studimet tona duke përdorur linjën e rrezes SPring-8 BL20B2, në të cilën ne vizualizuam lëvizjen e lëngut pas shpërndarjes së një doze të një vektori të rremë në rrugët e frymëmarrjes nazale dhe pulmonare të minjve për të ndihmuar në shpjegimin e modeleve tona heterogjene të shprehjes së gjeneve të vëzhguara. në gjenin tonë.studimet e kafshëve me një dozë bartës prej 3.4.
Qëllimi i këtij studimi ishte përdorimi i sinkrotronit PB-PCXI për të vizualizuar lëvizjet in vivo të një sërë deputetësh në trakenë e minjve të gjallë.Këto studime imazherike PB-PCXI u krijuan për të testuar serinë MP, forcën e fushës magnetike dhe vendndodhjen për të përcaktuar efektin e tyre në lëvizjen MP.Ne supozuam se një fushë magnetike e jashtme do të ndihmonte MF-në e dorëzuar të qëndronte ose të lëvizte në zonën e synuar.Këto studime na lejuan gjithashtu të përcaktojmë konfigurimin e magnetit që maksimizon sasinë e grimcave të mbetura në trake pas depozitimit.Në një seri të dytë studimesh, ne synuam të përdornim këtë konfigurim optimal për të demonstruar modelin e transduksionit që rezulton nga shpërndarja in vivo e LV-MPs në rrugët e frymëmarrjes së minjve, me supozimin se shpërndarja e LV-MPs në kontekstin e synimit të rrugëve ajrore do të rezultonte në rritjen e efikasitetit të transduksionit LV..
Të gjitha studimet e kafshëve u kryen në përputhje me protokollet e miratuara nga Universiteti i Adelaide (M-2019-060 dhe M-2020-022) dhe Komiteti i Etikës së Kafshëve Synchrotron SPring-8.Eksperimentet u kryen në përputhje me rekomandimet e ARIVE.
Të gjitha imazhet me rreze x janë marrë në rrezen BL20XU në sinkrotronin SPring-8 në Japoni duke përdorur një konfigurim të ngjashëm me atë të përshkruar më parë21,22.Shkurtimisht, kutia eksperimentale ndodhej 245 m nga unaza e ruajtjes së sinkrotronit.Një distancë nga mostra në detektor prej 0,6 m përdoret për studimet e imazhit të grimcave dhe 0,3 m për studimet e imazhit in vivo për të krijuar efekte të kontrastit fazor.Është përdorur një rreze monokromatike me energji 25 keV.Imazhet u morën duke përdorur një transduktor me rreze X me rezolucion të lartë (SPring-8 BM3) të shoqëruar me një detektor sCMOS.Transduktori konverton rrezet X në dritë të dukshme duke përdorur një scintilator 10 µm të trashë (Gd3Al2Ga3O12), i cili më pas drejtohet te sensori sCMOS duke përdorur një objektiv mikroskopi ×10 (NA 0.3).Detektori sCMOS ishte një Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japoni) me një madhësi grupi prej 2048 × 2048 piksele dhe një madhësi piksel të papërpunuar prej 6,5 × 6,5 µm.Ky cilësim jep një madhësi efektive izotropike të pikselit prej 0,51 µm dhe një fushë shikimi afërsisht 1,1 mm × 1,1 mm.Kohëzgjatja e ekspozimit prej 100 ms u zgjodh për të maksimizuar raportin sinjal-zhurmë të grimcave magnetike brenda dhe jashtë rrugëve të frymëmarrjes duke minimizuar artefaktet e lëvizjes të shkaktuara nga frymëmarrja.Për studimet in vivo, një kapak i shpejtë me rreze X u vendos në shtegun e rrezeve X për të kufizuar dozën e rrezatimit duke bllokuar rrezen e rrezeve X midis ekspozimeve.
Media LV nuk është përdorur në asnjë studim imazherie SPring-8 PB-PCXI, sepse dhoma e imazhit BL20XU nuk është e certifikuar e Nivelit 2 të Biosigurisë.Në vend të kësaj, ne zgjodhëm një sërë deputetësh të mirë-karakterizuar nga dy shitës komercialë që mbulojnë një sërë madhësish, materialesh, përqendrimi hekuri dhe aplikimesh, - së pari për të kuptuar se si fushat magnetike ndikojnë në lëvizjen e MP në kapilarët e qelqit, dhe më pas në rrugët e gjalla të frymëmarrjes.sipërfaqe.Madhësia e MP varion nga 0,25 në 18 μm dhe është bërë nga materiale të ndryshme (shih Tabelën 1), por përbërja e çdo kampioni, duke përfshirë madhësinë e grimcave magnetike në MP, është e panjohur.Bazuar në studimet tona të gjera MCT 19, 20, 21, 23, 24, ne presim që MP deri në 5 µm mund të shihen në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes trakeale, për shembull, duke zbritur kornizat e njëpasnjëshme për të parë dukshmërinë e përmirësuar të lëvizjes MP.Një MP i vetëm prej 0,25 µm është më i vogël se rezolucioni i pajisjes imazherike, por PB-PCXI pritet të zbulojë kontrastin e tyre vëllimor dhe lëvizjen e lëngut sipërfaqësor në të cilin ato janë depozituar pasi të depozitohen.
Mostrat për çdo deputet në tabelë.1 u përgatit në kapilarë qelqi 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) me diametër të brendshëm 0.63 mm.Grimcat korpuskulare janë të disponueshme në ujë, ndërsa grimcat CombiMag janë të disponueshme në lëngun e pronarit të prodhuesit.Çdo tub është gjysmë i mbushur me lëng (afërsisht 11 µl) dhe vendoset në mbajtësin e mostrës (shih Figurën 1).Kapilarët e qelqit u vendosën horizontalisht në skenë në dhomën e imazhit, përkatësisht dhe u pozicionuan në skajet e lëngut.Një magnet me guaskë nikeli me diametër 19 mm (28 mm i gjatë) i bërë nga tokë e rrallë, neodymium, hekur dhe bor (NdFeB) (N35, nr. kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australi) me një remanencë prej 1,17 T u ngjit në një tabela e veçantë e transferimit për të arritur Ndryshoni pozicionin tuaj në distancë gjatë paraqitjes.Imazhi me rreze X fillon kur magneti pozicionohet afërsisht 30 mm mbi mostrën dhe imazhet merren me 4 korniza për sekondë.Gjatë imazhit, magneti u afrua pranë tubit kapilar prej qelqi (në një distancë prej rreth 1 mm) dhe më pas u zhvendos përgjatë tubit për të vlerësuar efektin e forcës dhe pozicionit të fushës.
Një konfigurim imazherie in vitro që përmban mostra MP në kapilarët e qelqit në fazën e përkthimit të mostrës xy.Rruga e rrezes X është shënuar me një vijë të kuqe me pika.
Pasi u vërtetua dukshmëria in vitro e deputetëve, një nëngrup i tyre u testua in vivo në minjtë femra albino Wistar të tipit të egër (~ 12 javë, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japoni), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japoni) dhe butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Minjtë u anestezuan me përzierjen Pharma (Japoni) me injeksion intraperitoneal.Pas anestezisë, ata u përgatitën për imazhe duke hequr leshin rreth trakesë, duke futur një tub endotrakeal (ET; 16 Ga kanulë intravenoze, Terumo BCT) dhe duke i imobilizuar në pozicionin shtrirë në një pllakë imazherie të bërë me porosi që përmban një qese termike. për të ruajtur temperaturën e trupit.22. Pllaka e imazhit më pas u ngjit në fazën e mostrës në kutinë e imazhit në një kënd të lehtë për të rreshtuar trakenë horizontalisht në imazhin me rreze x, siç tregohet në figurën 2a.
(a) Konfigurimi i imazhit in vivo në njësinë e imazhit SPring-8, shtegu i rrezeve X të shënuar me vijë të kuqe me pika.(b,c) Lokalizimi i magnetit trakeal u krye nga distanca duke përdorur dy kamera IP të montuara në mënyrë ortogonale.Në anën e majtë të figurës në ekran, mund të shihni lakun e telit që mban kokën dhe kanulën e dorëzimit të instaluar brenda tubit ET.
Një sistem pompe shiringe me telekomandë (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) duke përdorur një shiringë qelqi 100 µl u lidh me një tub PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) duke përdorur një gjilpërë 30 Ga.Shënoni tubin për të siguruar që maja të jetë në pozicionin e duhur në trake kur futni tubin endotrakeal.Duke përdorur një mikropompë, pistoni i shiringës u hoq dhe maja e tubit u zhyt në kampionin MP që do të dorëzohej.Tubi i ngarkuar i dërgesës u fut më pas në tubin endotrakeal, duke e vendosur majën në pjesën më të fortë të fushës magnetike të aplikuar të pritur.Marrja e imazhit u kontrollua duke përdorur një detektor frymëmarrjeje të lidhur me kutinë tonë të kohës së bazuar në Arduino dhe të gjitha sinjalet (p.sh., temperatura, frymëmarrja, hapja/mbyllja e qepenit dhe marrja e imazhit) u regjistruan duke përdorur Powerlab dhe LabChart (AD Instruments, Sydney, Australi) 22 Kur imazhi Kur streha nuk ishte e disponueshme, dy kamera IP (Panasonic BB-SC382) u pozicionuan afërsisht 90° me njëra-tjetrën dhe u përdorën për të kontrolluar pozicionin e magnetit në lidhje me trakenë gjatë imazhit (Figura 2b, c).Për të minimizuar artefaktet e lëvizjes, një imazh për frymëmarrje u mor gjatë pllajës së rrjedhës së frymëmarrjes terminale.
Magneti është ngjitur në fazën e dytë, e cila mund të jetë e vendosur në distancë në pjesën e jashtme të trupit të imazhit.Janë testuar pozicione dhe konfigurime të ndryshme të magnetit, duke përfshirë: të vendosur në një kënd prej afërsisht 30° mbi trake (konfigurimet tregohen në figurat 2a dhe 3a);një magnet sipër kafshës dhe tjetri poshtë, me polet e vendosur për tërheqje (Figura 3b)., një magnet sipër kafshës dhe një poshtë, me polet e vendosur për zmbrapsje (Figura 3c) dhe një magnet sipër dhe pingul me trakenë (Figura 3d).Pas vendosjes së kafshës dhe magnetit dhe ngarkimit të MP nën provë në pompën e shiringës, jepni një dozë prej 50 µl me një shpejtësi prej 4 µl/sek pas marrjes së imazheve.Magneti më pas zhvendoset përpara dhe mbrapa përgjatë ose përgjatë trakesë, ndërsa vazhdon të marrë imazhe.
Konfigurimi i magnetit për imazhe in vivo (a) një magnet mbi trake në një kënd prej afërsisht 30°, (b) dy magnet të konfiguruar për tërheqje, (c) dy magnet të konfiguruar për zmbrapsje, (d) një magnet sipër dhe pingul me trake.Vëzhguesi shikoi poshtë nga goja në mushkëri përmes trakesë dhe rrezja e rrezeve X kaloi nëpër anën e majtë të miut dhe doli nga ana e djathtë.Magneti ose lëviz përgjatë gjatësisë së rrugës ajrore ose majtas dhe djathtas mbi trake në drejtim të rrezes së rrezeve X.
Ne kërkuam gjithashtu të përcaktonim dukshmërinë dhe sjelljen e grimcave në rrugët e frymëmarrjes në mungesë të përzierjes së frymëmarrjes dhe ritmit të zemrës.Prandaj, në fund të periudhës së imazherisë, kafshët u eutanizuan në mënyrë njerëzore për shkak të mbidozës së pentobarbitalit (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, SHBA; ~65 mg/kg ip).Disa kafshë u lanë në platformën e imazherisë dhe pas ndërprerjes së frymëmarrjes dhe rrahjeve të zemrës, procesi i imazhit u përsërit, duke shtuar një dozë shtesë MP nëse në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes nuk ishte e dukshme MP.
Imazhet që rezultuan u korrigjuan për fushë të sheshtë dhe të errët dhe më pas u grumbulluan në një film (20 korniza për sekondë; 15–25 × shpejtësi normale në varësi të shkallës së frymëmarrjes) duke përdorur një skript të personalizuar të shkruar në MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Të gjitha studimet mbi shpërndarjen e vektorit të gjenit LV u kryen në Qendrën e Kërkimeve të Kafshëve Laboratore të Universitetit të Adelaide dhe synonin të përdornin rezultatet e eksperimentit SPring-8 për të vlerësuar nëse shpërndarja e LV-MP në prani të një fushe magnetike mund të përmirësonte transferimin e gjeneve in vivo .Për të vlerësuar efektet e MF dhe fushës magnetike, u trajtuan dy grupe kafshësh: njërit grup iu injektua LV MF me vendosje magneti, dhe grupit tjetër u injektua me një grup kontrolli me LV MF pa magnet.
Vektorët e gjenit LV janë krijuar duke përdorur metodat e përshkruara më parë 25, 26.Vektori LacZ shpreh një gjen beta-galaktozidazë të lokalizuar bërthamor të drejtuar nga promotori konstituiv MPSV (LV-LacZ), i cili prodhon një produkt reaksioni blu në qelizat e transduktuara, të dukshme në pjesët e përparme dhe seksionet e indit të mushkërive.Titrimi u krye në kulturat qelizore duke numëruar manualisht numrin e qelizave LacZ-pozitive duke përdorur një hemocitometër për të llogaritur titrin në TU/ml.Transportuesit kriopservohen në -80°C, shkrihen përpara përdorimit dhe lidhen me CombiMag duke përzier 1:1 dhe duke u inkubuar në akull për të paktën 30 minuta përpara dorëzimit.
Minjtë normalë Sprague Dawley (n = 3/grup, ~2-3 ip të anestezuar me një përzierje prej 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australi) dhe 60 mg/kg ketaminë (Ilium, Australi) në moshën 1 muajshe) ip ) injeksion dhe kanulim oral jo-kirurgjikal me kanulë intravenoze 16 Ga.Për të siguruar që indet e rrugëve të frymëmarrjes trakeale të marrin transduksion LV, ajo u kushtëzua duke përdorur protokollin tonë të perturbimit mekanik të përshkruar më parë, në të cilin sipërfaqja e rrugëve të frymëmarrjes trakeale fërkohej në mënyrë boshtore me një shportë teli (N-Rrethi, nxjerrës guri nitinol pa majë NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 f.28.Më pas, rreth 10 minuta pas perturbimit në kabinetin e biosigurisë, u krye administrimi trakeal i LV-MP.
Fusha magnetike e përdorur në këtë eksperiment u konfigurua në mënyrë të ngjashme me një studim in vivo me rreze x, me të njëjtat magnet të mbajtur mbi trake me kapëse stent distilimi (Figura 4).Një vëllim prej 50 µl (2 x 25 µl pjesë) të LV-MP iu dorëzua trakesë (n = 3 kafshë) duke përdorur një pipetë me majë xhel siç përshkruhet më parë.Grupi i kontrollit (n = 3 kafshë) mori të njëjtën LV-MP pa përdorimin e një magneti.Pas përfundimit të infuzionit, kanula hiqet nga tubi endotrakeal dhe kafsha ekstubohet.Magneti qëndron në vend për 10 minuta para se të hiqet.Minjtë u dozuan në mënyrë subkutane me meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australi) i ndjekur nga tërheqja e anestezisë me injeksion intraperitoneal të 1 mg/kg hidroklorur atipamazole (Antisedan, Zoetis, Australi).Minjtë u mbajtën të ngrohtë dhe u vëzhguan deri në rikuperimin e plotë nga anestezia.
Pajisja e dorëzimit LV-MP në një kabinet sigurie biologjike.Ju mund të shihni që mëngja gri e lehtë Luer-lock e tubit ET del nga goja dhe maja e pipetës së xhelit, e treguar në figurë, futet përmes tubit ET në thellësinë e dëshiruar në trake.
Një javë pas procedurës së administrimit të LV-MP, kafshët u sakrifikuan në mënyrë njerëzore duke inhaluar 100% CO2 dhe shprehja e LacZ u vlerësua duke përdorur trajtimin tonë standard X-gal.Tre unazat më të kërcit kaudal u hoqën për të siguruar që çdo dëmtim mekanik ose mbajtje e lëngjeve për shkak të vendosjes së tubit endotrakeal nuk do të përfshihej në analizë.Çdo trake u pre për së gjati për të marrë dy gjysma për analizë dhe u vendos në një filxhan që përmban gome silikoni (Sylgard, Dow Inc) duke përdorur një gjilpërë Minutien (Fine Science Tools) për të vizualizuar sipërfaqen luminale.Shpërndarja dhe karakteri i qelizave të transduktuara u konfirmuan nga fotografia ballore duke përdorur një mikroskop Nikon (SMZ1500) me një aparat fotografik DigiLite dhe softuer TCapture (Tucsen Photonics, Kinë).Imazhet u morën me zmadhim 20x (duke përfshirë vendosjen maksimale për gjerësinë e plotë të trakesë), me të gjithë gjatësinë e trakesë të shfaqur hap pas hapi, duke siguruar mbivendosje të mjaftueshme midis çdo imazhi për të lejuar që imazhet të "qepeshin".Imazhet nga çdo trake u kombinuan më pas në një imazh të vetëm të përbërë duke përdorur versionin 2.0.3 të redaktuesit të imazhit të përbërë (Microsoft Research) duke përdorur algoritmin e lëvizjes planare. Zona e shprehjes LacZ brenda imazheve të përbëra trakeale nga secila kafshë u mat duke përdorur një skript të automatizuar MATLAB (R2020a, MathWorks) siç u përshkrua më parë28, duke përdorur cilësimet prej 0.35 <Hue <0.58, Saturation > 0.15 dhe Vlera <0.7. Zona e shprehjes së LacZ brenda imazheve të përbëra trakeale nga secila kafshë u përcaktua në sasi duke përdorur një skript të automatizuar MATLAB (R2020a, MathWorks) siç përshkruhet më parë28, duke përdorur cilësimet prej 0.35 <Hue <0.58, Saturation > 0.15 dhe Vlera <0.7. Ploщадь экспрессии LacZ në përbërjenыh isobrazhenijah trahei от каждого животного была количества të përcaktuara me përdorimin e skenave automatike të MATLAB (R2020a, MathWorks), si <1,5,0,5,28 ,7. Zona e shprehjes së LacZ në imazhet e përbëra trakeale nga secila kafshë u përcaktua duke përdorur një skript të automatizuar MATLAB (R2020a, MathWorks) siç përshkruhet më parë28 duke përdorur cilësimet prej 0.350,15 dhe vlera<0 ,7.如 前所 述 使用 自动 自动 自动 脚本 （R2020A ， MATHWORKS） 来自 来自 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 的 的 表达 区域 进行 量化 ， 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.7 的 设置。。 区域 进行 进行 使用 使用 使用 使用 使用 色调 色调 色调 色调 饱和度 饱和度 饱和度 饱和度 的 的 表达 表达 区域 区域 区域 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 表达 表达 表达 表达 中 图像 图像 图像 复合 复合 复合 复合 复合 图像 图像 图像 图像 图像 图像 图像 图像 图像 图像 复合 复合 复合 复合 （（（（（（（（（.如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 ........ .. Ekspresioni LacZ në përbërjenыh isobrazhenijah trahei kazhdogo jetësor koliчестvenno redeljali me përdorimin e automatizirovannogo skenarit të MATLAB (R2020a, MathWorks), si opisano ranee, si rezultat i përdorimit <0,00,000 . Zonat e shprehjes LacZ në imazhet e përbëra të trakesë së çdo kafshe u përcaktuan duke përdorur një skript të automatizuar MATLAB (R2020a, MathWorks) siç përshkruhet më parë duke përdorur cilësimet prej 0,35 < nuancë < 0,58, ngopje > 0,15 dhe vlerë < 0,7.Duke gjurmuar konturet e indeve në GIMP v2.10.24, një maskë u krijua manualisht për çdo imazh të përbërë për të identifikuar zonën e indit dhe për të parandaluar çdo zbulim të rremë jashtë indit trakeal.Zonat e njollosura nga të gjitha imazhet e përbëra nga çdo kafshë u përmblodhën për të dhënë sipërfaqen totale të njollosur për atë kafshë.Zona e lyer më pas u nda me sipërfaqen totale të maskës për të marrë një zonë të normalizuar.
Çdo trake u fut në parafinë dhe u nda me trashësi 5 μm.Seksionet u ngjyrosën me të kuqe të shpejtë neutrale për 5 minuta dhe imazhet u morën duke përdorur një mikroskop Nikon Eclipse E400, kamerë DS-Fi3 dhe softuer për kapjen e elementeve NIS (versioni 5.20.00).
Të gjitha analizat statistikore u kryen në GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Rëndësia statistikore u vendos në p ≤ 0.05.Normaliteti u testua duke përdorur testin Shapiro-Wilk dhe ndryshimet në ngjyrosjen LacZ u vlerësuan duke përdorur një T-test të pa çiftuar.
Gjashtë MP-të e përshkruar në Tabelën 1 u ekzaminuan nga PCXI dhe dukshmëria përshkruhet në Tabelën 2. Dy MP1 polistireni (MP1 dhe MP2; 18 µm dhe 0.25 µm, respektivisht) nuk ishin të dukshme nga PCXI, por mostrat e mbetura mund të identifikoheshin (shembuj janë paraqitur në Figurën 5).MP3 dhe MP4 janë dobët të dukshme (10-15% Fe3O4; 0,25 µm dhe 0,9 µm, respektivisht).Megjithëse MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) përmbante disa nga grimcat më të vogla të testuara, ishte më e theksuara.Produkti CombiMag MP6 është i vështirë për t'u dalluar.Në të gjitha rastet, aftësia jonë për të zbuluar MF-të u përmirësua shumë duke lëvizur magnetin përpara dhe mbrapa paralel me kapilarin.Ndërsa magnetët u larguan nga kapilarët, grimcat u tërhoqën në zinxhirë të gjatë, por ndërsa magnetët afroheshin dhe forca e fushës magnetike u rrit, zinxhirët e grimcave u shkurtuan ndërsa grimcat migruan drejt sipërfaqes së sipërme të kapilarit (shih videon shtesë S1 : MP4), duke rritur densitetin e grimcave në sipërfaqe.Anasjelltas, kur magneti hiqet nga kapilari, forca e fushës zvogëlohet dhe MP-të riorganizohen në zinxhirë të gjatë që shtrihen nga sipërfaqja e sipërme e kapilarit (shiko Video S2 plotësuese: MP4).Pasi magneti ndalon së lëvizuri, grimcat vazhdojnë të lëvizin për ca kohë pasi arrijnë pozicionin e ekuilibrit.Ndërsa MP lëviz drejt dhe larg sipërfaqes së sipërme të kapilarit, grimcat magnetike priren të tërheqin mbeturinat përmes lëngut.
Dukshmëria e MP nën PCXI ndryshon në mënyrë të konsiderueshme midis mostrave.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dhe (d) MP6.Të gjitha imazhet e paraqitura këtu janë marrë me një magnet të pozicionuar afërsisht 10 mm direkt mbi kapilar.Rrathët e mëdhenj të dukshëm janë flluska ajri të bllokuara në kapilarë, duke treguar qartë tiparet e skajit bardh e zi të imazhit të kontrastit fazor.Kutia e kuqe tregon zmadhimin që rrit kontrastin.Vini re se diametrat e qarqeve magnetike në të gjitha figurat nuk janë në shkallë dhe janë afërsisht 100 herë më të mëdha se sa tregohet.
Ndërsa magneti lëviz majtas dhe djathtas përgjatë majës së kapilarit, këndi i vargut MP ndryshon për t'u lidhur me magnetin (shih Figurën 6), duke përcaktuar kështu linjat e fushës magnetike.Për MP3-5, pasi korda arrin këndin e pragut, grimcat zvarriten përgjatë sipërfaqes së sipërme të kapilarit.Kjo shpesh rezulton në grupimin e deputetëve në grupe më të mëdha afër vendit ku fusha magnetike është më e fortë (shih Video S3 plotësuese: MP5).Kjo është gjithashtu veçanërisht e dukshme kur fotografoni afër fundit të kapilarit, gjë që bën që MP të grumbullohet dhe përqendrohet në ndërfaqen e lëngët-ajër.Grimcat në MP6, të cilat ishin më të vështira për t'u dalluar se ato në MP3-5, nuk zvarriteshin kur magneti lëvizte përgjatë kapilarit, por vargjet MP u shpërndanë, duke i lënë grimcat në pamje (shih videon plotësuese S4: MP6).Në disa raste, kur fusha magnetike e aplikuar u zvogëlua duke lëvizur magnetin në një distancë të gjatë nga vendi i imazhit, çdo deputet i mbetur zbriste ngadalë në sipërfaqen e poshtme të tubit nga graviteti, duke mbetur në varg (shih videon plotësuese S5: MP3) .
Këndi i vargut MP ndryshon ndërsa magneti lëviz në të djathtë mbi kapilar.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dhe (d) MP6.Kutia e kuqe tregon zmadhimin që rrit kontrastin.Ju lutemi vini re se videot shtesë janë për qëllime informative pasi ato zbulojnë strukturën e grimcave të rëndësishme dhe informacionin dinamik që nuk mund të vizualizohet në këto imazhe statike.
Testet tona kanë treguar se lëvizja e magnetit përpara dhe mbrapa ngadalë përgjatë trakesë lehtëson vizualizimin e MF në kontekstin e lëvizjes komplekse in vivo.Nuk u kryen teste in vivo sepse rruazat e polistirenit (MP1 dhe MP2) nuk ishin të dukshme në kapilar.Secila nga katër MF-të e mbetura u testua in vivo me boshtin e gjatë të magnetit të pozicionuar mbi trake në një kënd prej rreth 30° në vertikale (shih figurat 2b dhe 3a), pasi kjo rezultoi në zinxhirë më të gjatë MF dhe ishte më efektiv se një magnet..konfigurimi përfundoi.MP3, MP4 dhe MP6 nuk janë gjetur në trakenë e ndonjë kafshe të gjallë.Gjatë vizualizimit të traktit respirator të minjve pas vrasjes njerëzore të kafshëve, grimcat mbetën të padukshme edhe kur u shtua vëllim shtesë duke përdorur një pompë shiringe.MP5 kishte përmbajtjen më të lartë të oksidit të hekurit dhe ishte e vetmja grimcë e dukshme, kështu që u përdor për të vlerësuar dhe karakterizuar sjelljen e MP in vivo.
Vendosja e magnetit mbi trake gjatë futjes së MF rezultoi që shumë, por jo të gjitha, MF të përqendroheshin në fushën e shikimit.Hyrja e grimcave në trake vërehet më së miri te kafshët e eutanizuara në mënyrë njerëzore.Figura 7 dhe video plotësuese S6: MP5 tregon kapjen e shpejtë magnetike dhe shtrirjen e grimcave në sipërfaqen e trakesë ventrale, duke treguar se MP-të mund të synohen në zonat e dëshiruara të trakesë.Gjatë kërkimit më distalisht përgjatë trakesë pas dorëzimit të MF, disa MF u gjetën më afër karinës, gjë që tregon forcë të pamjaftueshme të fushës magnetike për të mbledhur dhe mbajtur të gjithë MF-të, pasi ato u shpërndanë përmes rajonit të fuqisë maksimale të fushës magnetike gjatë administrimit të lëngut.procesi.Sidoqoftë, përqendrimet e MP pas lindjes ishin më të larta rreth zonës së imazhit, duke sugjeruar që shumë MP mbetën në rajonet e rrugëve të frymëmarrjes ku forca e fushës magnetike të aplikuar ishte më e larta.
Imazhet e (a) para dhe (b) pas dërgimit të MP5 në trake të një miu të eutanizuar së fundmi me një magnet të vendosur pak mbi zonën e imazhit.Zona e përshkruar ndodhet midis dy unazave kërcore.Ka pak lëngje në rrugët e frymëmarrjes përpara se të dorëzohet MP.Kutia e kuqe tregon zmadhimin që rrit kontrastin.Këto imazhe janë marrë nga videoja e paraqitur në S6: MP5 Suplementary Video.
Lëvizja e magnetit përgjatë trakesë in vivo rezultoi në një ndryshim në këndin e zinxhirit MP në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes, të ngjashëm me atë të vërejtur në kapilarët (shih Figurën 8 dhe Video Suplementare S7: MP5).Megjithatë, në studimin tonë, deputetët nuk mund të tërhiqeshin zvarrë përgjatë sipërfaqes së rrugëve të gjalla të frymëmarrjes, siç mund të bënin kapilarët.Në disa raste, zinxhiri MP zgjatet ndërsa magneti lëviz majtas dhe djathtas.Interesante, ne zbuluam gjithashtu se zinxhiri i grimcave ndryshon thellësinë e shtresës sipërfaqësore të lëngut kur magneti lëvizet gjatësore përgjatë trakesë dhe zgjerohet kur magneti zhvendoset drejtpërdrejt lart dhe zinxhiri i grimcave rrotullohet në një pozicion vertikal (shih Video S7 plotësuese).: MP5 në 0:09, poshtë djathtas).Modeli karakteristik i lëvizjes ndryshoi kur magneti u zhvendos anash në pjesën e sipërme të trakesë (dmth. majtas ose djathtas të kafshës, dhe jo përgjatë gjatësisë së trakesë).Grimcat ishin ende qartësisht të dukshme gjatë lëvizjes së tyre, por kur magneti u hoq nga trakea, majat e vargjeve të grimcave u bënë të dukshme (shiko Video S8 suplementare: MP5, duke filluar nga ora 0:08).Kjo përputhet me sjelljen e vëzhguar të fushës magnetike nën veprimin e një fushe magnetike të aplikuar në një kapilar xhami.
Shembuj imazhesh që tregojnë MP5 në trakenë e një miu të gjallë të anestezuar.(a) Magneti përdoret për të marrë imazhe sipër dhe majtas të trakesë, pastaj (b) pasi të lëvizë magnetin në të djathtë.Kutia e kuqe tregon zmadhimin që rrit kontrastin.Këto imazhe janë nga videoja e paraqitur në videon plotësuese të S7: MP5.
Kur dy polet u akorduan në një orientim veri-jug sipër dhe poshtë trakesë (d.m.th., duke tërhequr; Fig. 3b), kordat MP dukeshin më të gjata dhe ishin të vendosura në murin anësor të trakesë dhe jo në sipërfaqen dorsale të trakesë. trake (shih Shtojcën).Video S9:MP5).Megjithatë, përqendrimet e larta të grimcave në një vend (dmth, sipërfaqja dorsale e trakesë) nuk u zbuluan pas administrimit të lëngut duke përdorur një pajisje magnetike të dyfishtë, e cila zakonisht ndodh me një pajisje magnetike të vetme.Pastaj, kur një magnet u konfigurua për të zmbrapsur polet e kundërta (Figura 3c), numri i grimcave të dukshme në fushën e shikimit nuk u rrit pas dorëzimit.Vendosja e të dy dy konfigurimeve të magnetit është sfiduese për shkak të forcës së lartë të fushës magnetike e cila tërheq ose shtyn përkatësisht magnetët.Vendosja u ndryshua më pas në një magnet të vetëm paralel me rrugët e frymëmarrjes, por që kalonte nëpër rrugët e frymëmarrjes në një kënd 90 gradë në mënyrë që linjat e forcës të kalonin murin e trakesë në mënyrë ortogonale (Figura 3d), një orientim që synon të përcaktojë mundësinë e grumbullimit të grimcave në murin anësor.të vëzhgohen.Sidoqoftë, në këtë konfigurim, nuk kishte lëvizje të identifikueshme të akumulimit të MF ose lëvizje magnetike.Bazuar në të gjitha këto rezultate, një konfigurim me një magnet të vetëm dhe një orientim 30 gradë u zgjodh për studimet in vivo të bartësve të gjeneve (Fig. 3a).
Kur kafsha u fotografua shumë herë menjëherë pas sakrifikimit njerëzor, mungesa e lëvizjes ndërhyrëse të indeve nënkuptonte se linjat më të imta dhe më të shkurtra të grimcave mund të dalloheshin në fushën e qartë ndërkartilaginoze, duke 'lëkundur' në përputhje me lëvizjen përkthimore të magnetit.shikoni qartë praninë dhe lëvizjen e grimcave MP6.
Titri i LV-LacZ ishte 1,8 x 108 IU/mL, dhe pas përzierjes 1:1 me CombiMag MP (MP6), kafshëve iu injektuan 50 μl të një doze trakeale prej 9 x 107 IU/ml mjet LV (dmth 4,5 x 106 TU/rat).)).Në këto studime, në vend që të lëviznim magnetin gjatë lindjes, ne e fiksuam magnetin në një pozicion për të përcaktuar nëse transduksioni LV mund (a) të përmirësohej në krahasim me shpërndarjen vektoriale në mungesë të një fushe magnetike dhe (b) nëse rruga e frymëmarrjes mund të të jetë i fokusuar.Qelizat duke u transduktuar në zonat e synuara magnetike të traktit të sipërm respirator.
Prania e magneteve dhe përdorimi i CombiMag në kombinim me vektorët LV nuk duket se ndikon negativisht në shëndetin e kafshëve, siç bëri protokolli ynë standard i shpërndarjes së vektorit LV.Imazhet frontale të rajonit të trakesë që i nënshtrohen shqetësimeve mekanike (Fig. Suplementare 1) treguan se grupi i trajtuar me LV-MP kishte nivele dukshëm më të larta të transduksionit në prani të një magneti (Fig. 9a).Vetëm një sasi e vogël e ngjyrosjes blu LacZ ishte e pranishme në grupin e kontrollit (Figura 9b).Kuantifikimi i rajoneve të normalizuara të ngjyrosura me X-Gal tregoi se administrimi i LV-MP në prani të një fushe magnetike rezultoi në një përmirësim afërsisht 6-fish (Fig. 9c).
Shembull i imazheve të përbëra që tregojnë transduksion trakeal me LV-MP (a) në prani të një fushe magnetike dhe (b) në mungesë të një magneti.(c) Përmirësim statistikisht domethënës në zonën e normalizuar të transduksionit të LacZ në trake me përdorimin e një magneti (*p = 0,029, t-test, n = 3 për grup, mesatarja ± gabim standard i mesatares).
Seksionet neutrale të shpejta me njolla të kuqe (shembulli i treguar në Fig. 2 plotësuese) treguan se qelizat e ngjyrosura me LacZ ishin të pranishme në të njëjtin kampion dhe në të njëjtin vend siç u raportua më parë.
Sfida kryesore në terapinë gjenetike të rrugëve të frymëmarrjes mbetet lokalizimi i saktë i grimcave bartëse në zonat me interes dhe arritja e një niveli të lartë të efikasitetit të transduksionit në mushkëritë e lëvizshme në prani të rrjedhës së ajrit dhe pastrimit aktiv të mukusit.Për transportuesit LV të destinuara për trajtimin e sëmundjeve të frymëmarrjes në fibrozën cistike, rritja e kohës së qëndrimit të grimcave bartëse në rrugët e frymëmarrjes përcjellëse ka qenë deri tani një qëllim i paarritshëm.Siç theksohet nga Castellani et al., përdorimi i fushave magnetike për të përmirësuar transduksionin ka përparësi ndaj metodave të tjera të shpërndarjes së gjeneve si elektroporimi, sepse mund të kombinojë thjeshtësinë, ekonominë, shpërndarjen e lokalizuar, rritjen e efikasitetit dhe kohën më të shkurtër të inkubacionit.dhe mundësisht një dozë më të ulët të mjetit10.Megjithatë, depozitimi in vivo dhe sjellja e grimcave magnetike në rrugët e frymëmarrjes nën ndikimin e forcave të jashtme magnetike nuk është përshkruar kurrë, dhe në fakt aftësia e kësaj metode për të rritur nivelet e shprehjes së gjeneve në rrugët ajrore të gjalla të paprekura nuk është demonstruar in vivo.
Eksperimentet tona in vitro në sinkrotronin PCXI treguan se të gjitha grimcat që testuam, me përjashtim të polistirenit MP, ishin të dukshme në konfigurimin e imazhit që përdorëm.Në prani të një fushe magnetike, fushat magnetike formojnë vargje, gjatësia e të cilave lidhet me llojin e grimcave dhe fuqinë e fushës magnetike (dmth, afërsia dhe lëvizja e magnetit).Siç tregohet në Figurën 10, vargjet që vëzhgojmë formohen kur çdo grimcë individuale magnetizohet dhe indukton fushën e saj magnetike lokale.Këto fusha të veçanta bëjnë që grimcat e tjera të ngjashme të mblidhen dhe të lidhen me lëvizjet e vargut në grup për shkak të forcave lokale nga forcat lokale të tërheqjes dhe zmbrapsjes së grimcave të tjera.
Diagrami që tregon (a, b) zinxhirët e grimcave që formohen brenda kapilarëve të mbushur me lëng dhe (c, d) një trake të mbushur me ajër.Vini re se kapilarët dhe trakeja nuk janë tërhequr në shkallë.Paneli (a) përmban gjithashtu një përshkrim të MF që përmban grimca Fe3O4 të renditura në zinxhirë.
Kur magneti lëvizte mbi kapilar, këndi i vargut të grimcave arriti pragun kritik për MP3-5 që përmban Fe3O4, pas së cilës vargu i grimcave nuk mbeti më në pozicionin e tij origjinal, por lëvizi përgjatë sipërfaqes në një pozicion të ri.magnet.Ky efekt ka të ngjarë të ndodhë sepse sipërfaqja e kapilarit të qelqit është mjaft e lëmuar për të lejuar që kjo lëvizje të ndodhë.Interesante, MP6 (CombiMag) nuk u soll në këtë mënyrë, ndoshta sepse grimcat ishin më të vogla, kishin një shtresë ose ngarkesë të ndryshme sipërfaqësore, ose lëngu mbajtës i pronarit ndikoi në aftësinë e tyre për të lëvizur.Kontrasti në imazhin e grimcave CombiMag është gjithashtu më i dobët, duke sugjeruar që lëngu dhe grimcat mund të kenë të njëjtën densitet dhe për këtë arsye nuk mund të lëvizin lehtësisht drejt njëri-tjetrit.Grimcat gjithashtu mund të ngecin nëse magneti lëviz shumë shpejt, duke treguar se forca e fushës magnetike nuk mund të kapërcejë gjithmonë fërkimin midis grimcave në lëng, duke sugjeruar që forca e fushës magnetike dhe distanca midis magnetit dhe zonës së synuar nuk duhet të vijnë si surprizë.e rëndësishme.Këto rezultate tregojnë gjithashtu se megjithëse magnetët mund të kapin shumë mikrogrimca që rrjedhin nëpër zonën e synuar, nuk ka gjasa që magnetët të mund të mbështeten për të lëvizur grimcat CombiMag përgjatë sipërfaqes së trakesë.Kështu, ne arritëm në përfundimin se studimet in vivo LV MF duhet të përdorin fusha magnetike statike për të synuar fizikisht zona specifike të pemës së rrugëve të frymëmarrjes.
Pasi grimcat dërgohen në trup, ato janë të vështira për t'u identifikuar në kontekstin e indit kompleks lëvizës të trupit, por aftësia e tyre e zbulimit është përmirësuar duke lëvizur magnetin horizontalisht mbi trake për të "lëkundur" vargjet MP.Ndërsa imazhi në kohë reale është i mundur, është më e lehtë të dallosh lëvizjen e grimcave pasi kafsha të jetë vrarë në mënyrë njerëzore.Përqendrimet e MP zakonisht ishin më të lartat në këtë vend kur magneti ishte i pozicionuar mbi zonën e imazhit, megjithëse disa grimca zakonisht gjendeshin më poshtë në trake.Ndryshe nga studimet in vitro, grimcat nuk mund të tërhiqen zvarrë poshtë trakesë nga lëvizja e një magneti.Ky zbulim është në përputhje me mënyrën se si mukusi që mbulon sipërfaqen e trakesë zakonisht përpunon grimcat e thithura, duke i bllokuar ato në mukozë dhe më pas duke i pastruar ato përmes mekanizmit të pastrimit muko-ciliar.
Ne supozuam se përdorimi i magneteve sipër dhe poshtë trakesë për tërheqje (Fig. 3b) mund të rezultojë në një fushë magnetike më uniforme, në vend të një fushe magnetike që është shumë e përqendruar në një pikë, duke rezultuar potencialisht në një shpërndarje më uniforme të grimcave..Megjithatë, studimi ynë paraprak nuk gjeti prova të qarta për të mbështetur këtë hipotezë.Në mënyrë të ngjashme, vendosja e një çifti magnetësh për t'u zmbrapsur (Fig. 3c) nuk rezultoi në vendosjen e më shumë grimcave në zonën e imazhit.Këto dy gjetje tregojnë se konfigurimi me magnet të dyfishtë nuk përmirëson ndjeshëm kontrollin lokal të treguesit MP dhe se forcat e forta magnetike që rezultojnë janë të vështira për t'u sintonizuar, duke e bërë këtë qasje më pak praktike.Në mënyrë të ngjashme, orientimi i magnetit sipër dhe përgjatë trakesë (Figura 3d) gjithashtu nuk rriti numrin e grimcave të mbetura në zonën e imazhit.Disa nga këto konfigurime alternative mund të mos jenë të suksesshme pasi ato rezultojnë në një reduktim të forcës së fushës magnetike në zonën e depozitimit.Kështu, konfigurimi i një magneti të vetëm në 30 gradë (Fig. 3a) konsiderohet metoda më e thjeshtë dhe më efikase e testimit in vivo.
Studimi LV-MP tregoi se kur vektorët LV u kombinuan me CombiMag dhe u dorëzuan pasi u shqetësonin fizikisht në prani të një fushe magnetike, nivelet e transduksionit u rritën ndjeshëm në trake në krahasim me kontrollet.Bazuar në studimet e imazhit sinkrotron dhe rezultatet e LacZ, fusha magnetike dukej se ishte në gjendje të mbante LV në trake dhe të zvogëlonte numrin e grimcave vektoriale që depërtuan menjëherë thellë në mushkëri.Përmirësime të tilla të synimit mund të çojnë në efikasitet më të lartë duke reduktuar titrat e dorëzuar, transduksionin jo të synuar, efektet anësore inflamatore dhe imune dhe kostot e transferimit të gjeneve.E rëndësishmja, sipas prodhuesit, CombiMag mund të përdoret në kombinim me metoda të tjera të transferimit të gjeneve, duke përfshirë vektorë të tjerë viralë (si AAV) dhe acide nukleike.